γδT-selection

DN 段階でTCRγ鎖とδ鎖の再配列が起こり、胸腺細胞からγδT細胞が出てくる …続きを読む TCRγとδTCRが組み換わる前のγδ前駆細胞は、プレTCRと同様にγδTCR複合体を細胞膜上に発現し、細胞内シグナル伝達経路を開始させる . このγδTCRシグナルは、「γγδδ-selection」と呼ばれるプロセスを誘導し、機能的なTCR鎖の生成を確認し、細胞に「私はγδT細胞だ」と認識させる。

γδ-selectionシグナルは、CD5- CD24highγδ前駆細胞からCD5+ CD24lowγδTコミット細胞へと分化するきっかけを作る . Syk欠損マウスではCD5-からCD5+ γδT細胞への分化が著しく阻害されるが、Zap70欠損マウスではCD5+ γδT細胞の正常な分化が認められる。 Zap70/Syk二重欠損マウスでは、CD5-前駆体段階でのγδT細胞の分化が完全に停止している。 このように、γδT細胞の分化は主にSykを介したシグナルに依存し、Zap70はこのプロセスにおいて冗長でわずかな役割を果たすに過ぎないのである。 このメカニズムは、β-selectionのメカニズムと非常に類似している。 Syk/Zap70欠損マウスやLat欠損マウスのαβT前駆細胞は、γδTCRを除く細胞表面タンパク質の発現からαβT系細胞との区別がつかないが、αβT細胞への分化の可能性を維持している。 前駆細胞からαβT系やγδT系への分化運命は何によって決定されるのだろうか。 この疑問は、γδTCRトランスジェニックマウスを用いた研究により解決された。 トランスジェニックγδTCRのシグナル伝達タンパク質や内因性リガンドが欠損してγδTCRシグナルが弱まった場合、前駆細胞はαβT系統のDP細胞を生じ、γδT系統のDP細胞は犠牲になった。 これらの結果は、より強いシグナル（γδTCRリガンド相互作用によるものと思われる）がγδT細胞へのコミットメントにつながり、より弱いシグナル（リガンド非依存性プレTCRによるものと思われる）がαβT分化につながることを示唆するものであった。 しかし、同じリガンド特異性を持つγδTCRを発現する別のトランスジェニックマウス株を用いた実験では、γδT細胞はリガンドの非存在下でも成熟できることが示された . Chienらは、非トランスジェニックマウスにおける内因性γδTCRリガンドの意義を検討するために、4量体染色法を用いてリガンド特異的なγδT細胞集団を同定した。 その結果、リガンド特異的なγδT細胞の数は、リガンドがないマウスとないマウスの間で同程度であり、大部分のγδT細胞は胸腺分化の過程でリガンドに遭遇していないことが明らかになった。 また、著者らは、いくつかのγδTCRはリガンドに依存せずにシグナル伝達することができるという証拠も示している。 これらの観察は、γδT系統のコミットメントにはγδTCRリガンドの相互作用が必要であるという従来のモデルと明らかに矛盾している。 ある種の外来性リガンドに反応するポリクローナルγδT細胞は胸腺で分化し機能的に成熟することから、特定のγδTCRトランスジェニックマウス系統における観察は、ポリクローナルγδTCRを持つγδT細胞の大部分を反映していない可能性がある。

αβT/γδT分化におけるγδβ選択シグナルの影響を調べるために、γδT細胞の分化がCD5前駆段階で停止しているLat欠損マウスを利用しました。 成体のLat欠損マウスからγδTCR+前駆細胞を精製し、Latを発現するレトロウイルスを感染させ、ストローマ細胞単層で培養した（図2a）。 この実験により、リガンドフリー条件下でのγδ選択前後の細胞表現型を直接評価することができる。 非導入対照細胞と比較して、Lat発現γδT細胞は、CD5の表面発現の顕著な誘導（図2b）、ならびにγδT細胞特徴遺伝子（Tcrd、Egr3、Runx3、Bcl-2）のmRNA発現、前駆DN細胞およびαβT細胞（Rag1、Rag2、Ptcra）に関する遺伝子の転写が完全に阻害された（図2c）ことが確認された。 これらの結果は、γδTCRシグナルがリガンド非依存的にαβT系統への分化を促進し、かつαβT系統への分化を抑制することを示す。

図2

まとめると、プレTCRとγδTCRがそれぞれαβTとγδT系統への分化過程を指示するメカニズムはまだ不明であるが（そして議論もある）、少なくとも自然発生したγδT細胞の大半において、胸腺における同族γδTCRリガンドに依存したγδ選択性はない可能性が高いことがわかる。

γδTCR signal strength determining γδT17/γδT1 differentiation

αβT系とγδT系の発生過程において、SykとZap70の発現が逆調節されている。 Sykは初期（DN1-3、γδ前駆体）に高発現し、その後ダウンレギュレートされるが、Zap70は後期（β選択、γδ選択後）に高発現し、γδTCR/CD3複合体と同時にZap70も高レベルで発現し、胸腺で内因性リガンドが供給されるとそれに応答することができる。 現在、αβT細胞と異なり、γδT細胞は胸腺においてリガンド駆動型のポジティブセレクションやクローン欠失を起こさないことが認識されている。 胸腺におけるγδTCRリガンド相互作用が、代わりにγδT細胞のエフェクター機能を制御していることが、いくつかの研究により示唆されている。

非古典的MHCクラスI分子T10およびT22に反応するγδT細胞集団の4量体染色を用いて、Chienのグループは、リガンドの非存在下で発生した抗原未経験のγδT細胞は優先的にIL-17を生産し、一方リガンドの存在下で発生した抗原経験のあるγδT細胞は優位にIFNγを生産することを見出しました。 この研究は、リガンドによる強いγδTCRシグナルと弱いγδTCRシグナルが、それぞれγδT1細胞とγδT17細胞を誘導するという考えを最初に提示したものである。 新たに作製したT10/T22欠損マウスを用いた最近の研究でも、基本的に同じ結果が報告されており、この「シグナル強度モデル」が支持されている。 このモデルは、他の研究でもさらに支持されている。 Vγ5Vδ1 γδT細胞の胸腺成熟とエフェクター分化には、Vγ5Vδ1 TCRの推定コスティミュレーション蛋白であるSkint1（そしておそらく他のSkintファミリー蛋白も）が必要である . Skint1がない場合、Vγ5Vδ1γδΤ17細胞は、γδΤ1細胞の表現型を犠牲にして、γδΤ17細胞の表現型に誘導される。 さらに、γδT1細胞の発生には、γδT17細胞ではなく、γδT1細胞に発現するTNF受容体スーパーファミリータンパク質であるCD27を介したコスティミュレーションも必要である . さらに最近、Penningtonのグループは、γδT17細胞とγδT1細胞の両方を生み出すことができる胸腺二重能γδT細胞（CD24lo CD44lo CD45RBlo）を同定した。 胎児胸腺器官培養において、γδT17細胞の発生は、抗TCRδ抗体または抗CD3ε抗体による刺激で誘導される強いTCRシグナルによって抑制されたが、これらの効果はMEK/ERK経路の薬理学的阻害によって代償された.

転写レベルでは、強いγδTCRシグナルは、Egr2、Egr3、Id3などのγδT1-関連転写制御因子の発現を誘導し、γδT1細胞の運命を決定する． Id3は、HEB（Tcf12によってコードされる）を介した転写調節を阻害することによって、γδT17細胞運命の採用を抑制する。 HEB は Sox4 と Sox13 の転写開始点上流に直接結合し、それらの発現を促進することができる。 これらのγδT17関連転写因子は、必須転写因子RORγt（Rorcによってコードされている）とシグナル伝達タンパク質Blkの発現に必要である。 しかし、一連の研究により、TCRシグナル伝達分子の遺伝子破壊がγδT細胞のエフェクター機能に影響を与えることが明らかになり、γδTCRのシグナル強度のみがγδT17/γδT1の分化運命を決定するという考え方は否定されることになった。 Zap70 W163C変異マウスでは、Vγ6+ γδT17細胞の発生が完全に失われるが、γδT1細胞の発生は正常であり、TCRシグナルは減衰している 。 Silva-Santosらによる別の研究では、CD3δおよびCD3γのハプロ不全マウス（CD3DH）は、細胞表面でのγδTCR/CD3複合体の発現が低く、γδTCRシグナル伝達が損なわれていることが示されている。 は、Vγ6+ γδT17細胞とγδT1細胞の胸腺発達を著しく低下させたが、Vγ4+ γδT17細胞の発達には、個別のγδTCRシグナル強度を必要とすることが示された。 CD3DHマウスでは、αβT細胞の発生とαβTCRシグナル伝達は影響を受けなかったが、このマウス系統は、γδTCRシグナルの特異的阻害が証明された唯一の動物モデルである。 CD3DHマウスでγδT細胞が特異的に影響を受ける理由はまだ不明であるが、TCR-CD3複合体のαβT細胞とγδT細胞の異なる構成がCD3DHマウスのユニークな表現型を説明するものと思われる。 3141>

Syk is required for γδT17 differentiation

Recently, we reported a new regulatory mechanism that the γδTCR-proximal kinases Syk and Zap70 differentially control γδT17 induction …TCRの構造変化を引き起こすことのできないCD3-C80G突然変異をもつマウスは、 γδT17 細胞の発達に障害を示すがγδT1細胞の発達には異常がない。 Syk欠損マウスでは、胸腺のγδT17細胞（Vγ4+およびVγ6+サブセットの両方）が完全に消失していることがわかった。 注目すべきは、Syk欠損T前駆細胞にZap70を強制発現させても、γδT17細胞の生成を回復できないことである。これは、γδT17分化におけるSykの役割が重複していないことを示唆している。 Syk-ではなく Zap70 欠損の γδT 細胞は、γδTCR 刺激によって誘導される Akt リン酸化の有意な減少を示すことから、 Syk が γδTCR 誘導 PI3K-Akt 経路の活性化を仲介していることが示唆された。 PI3K欠損マウス（p110γ-/- p110δ-/-） は、γδT17細胞の発生を完全に阻害するが、γδ選択性（CD5アップレギュレーション）やγδT1発生には影響を与えないことがわかった。 PI3Kを阻害すると、γδT17関連転写因子（Rorc、Sox13、Sox4）の発現が低下することから、PI3K-Akt経路がγδT17分化プログラムの誘導に重要な役割を担っていることが示唆された。 これと同様に、キナーゼ不活性 PI3Kδ あるいは PI3Kγ 欠損マウスは、末梢の γδT17 細胞数が著しく減少し、γδT17 依存性の炎症が改善することが、以前の報告で示されている。 PI3K-Akt経路は、IL-17産生αβT（Th17）細胞の分化にも必要であり、このシグナル伝達経路は、IL-17産生炎症性サブセットを誘導するためのαβT系とγδT系に共通する調節機構であることが示唆された。

γδTCRによるPI3K-Akt経路の活性化は、LatではなくSykに依存しており、Sykは、γδ選択性を誘導するLat依存性の主流シグナル伝達経路に加えて、γδT17分化を誘導するPI3K-Akt経路を駆動することが示唆された 。 Sykが、γδT細胞のPI3K/Akt経路を直接相互作用によって活性化するか、間接的に活性化するかは不明である。 以前の研究では、Rasgrp1 欠損マウスは PI3K 欠損マウスと同様に γδT 細胞のエフェクター表現型（すなわち γδT17 細胞の損失と γδT1 細胞の増加）を示すことが報告されている。 Rasgrp1 はαβTCR シグナルにおける PI3K/Akt 経路の上流活性化因子として機能することから、Rasgrp1 が γδTCR からのシグナルを PI3K に中継して γδT17 の分化を誘導している可能性が考えられた。

γδTCRシグナル伝達におけるその機能は不明であるが、B細胞と同様にγδT細胞に発現するSrcファミリーキナーゼであるBlkの欠損マウスにおいても、γδT17細胞の優先的損失が報告されている。

Zap70は特定のγδT細胞サブセットを制御する

私たちはまたZap70が胸腺分化に役割を果たすことを実証している 。 Zap70欠損マウスでは、Vγ6+細胞（その大部分はγδT17）が著しく減少するが、Vγ1+およびVγ4+サブセットを含む他のγδT細胞の発生には影響がない。 実際、Zap70タンパク質の発現量は、γδT細胞の中でもVγ6+サブセットで最も高かった。 Zap70欠損Vγ6+細胞ではCD5の発現が対照細胞より低かったことから、Zap70はVγ6+細胞の胸腺成熟に必要であると思われる。 我々の実験では、Zap70欠損マウスは、γδT17サブセットを含むVγ4+細胞の胸腺分化が正常であり、これは、低形質Zap70突然変異が胸腺Vγ4+γδT17細胞の減少を引き起こすという以前の報告とは矛盾していた 。 この相違は、2つの研究で使用したマウスの違いに起因すると思われる（HaydayのグループはBALB/cバックグラウンドの低形質Zap70突然変異体マウスを使用したが、我々はC57BL/6バックグラウンドの完全Zap70欠損マウスを使用した）。 さらに、Zap70欠損マウスは、γδT17とγδT1サブセットの両方を含む末梢Vγ4+細胞の著しい減少を示したが、Vγ1+細胞は損なわれていなかった。 このように、αβT細胞の発生におけるZap70の必須の役割とは対照的に、Zap70の必要性はVγ6+細胞の胸腺成熟とVγ4+細胞の末梢維持に限られている。

Zap70とSykの異なる役割に関する我々の発見は、γδTCRシグナルとγδT細胞発生のメカニズムを理解するための新しい手がかりとなるかもしれない。 Zap70は、特定のγδT細胞サブセットにおいて、αβTCRシグナルとγδTCRシグナルに必要である。 αβT細胞では、Zap70の活性化は、抗原提示細胞表面のpMHCに結合するCD4またはCD8コアセプターと結合しているLckに依存している 。 このように、Lck-Zap70は細胞間接触による抗原認識に特化したシグナル伝達軸であることが示唆されるが、γβT細胞の場合、CD4やCD8の発現がないにもかかわらず、Zap70がどのように活性化されるかは不明であった。 一方、Sykはpre-TCR、γδTCR、BCR、FcRなど様々な免疫受容体と結合している。 SykはLckなどのSrcファミリーキナーゼとは独立してITAMやその下流の標的をリン酸化することができるので、これらの受容体はリガンドに依存せず、あるいは様々な可溶性抗原や細胞表面抗原との結合により活性化することができる。 したがって、免疫受容体のシグナル伝達におけるSykやZap70の利用は、受容体がどのように抗原を認識するかを決定している可能性がある。 実際、Zap70の代わりにSykを発現させると、αβT細胞は可溶性抗CD3抗体刺激に応答するようになったが、通常のαβT細胞は細胞表面pMHCとの相互作用を模倣した多量化抗CD3抗体のみに応答するようになった . これらの結果から、リンパ球の抗原認識様式は、受容体そのものだけでなく、Sykファミリーキナーゼの使い分けによって決定されているのではないかという仮説を立てました。 この考えに基づき、Vγ6+細胞の胸腺成熟と末梢維持に必要な内因性γδTCRリガンドと、Vγ1+細胞の発生や維持に必要な内因性γδTCRリガンドが存在すると予想される。

γδT17細胞の誘導におけるγδTCR非依存性および依存性プロセス

最近の報告では、γδT17細胞が他のγδT細胞サブセットとは異なる前駆細胞から生じることがエレガントに証明された。 これまでDN1d（CD44+CD25-c-kit-CD24hi）胸腺細胞と分類されていた集団に、Sox13を高レベルで発現する胎児由来の胸腺内前駆細胞が同定されたことが報告されている。 これらのSox13陽性前駆細胞は、再構成された胎児胸腺において、γδT17細胞を優先的に生み出すが、DN2集団内の他の前駆細胞は生み出さなかった。 最も重要なことは、Sox13+前駆細胞はTCR欠損マウスやRag欠損マウスでも検出可能であり、そのγδT17系譜プログラムは無傷だったことで、γδT17系譜運命は細胞内在性のγδTCR非依存性機構によって「あらかじめ」設定されていることが示されたことである。 しかし、以前の報告では、γδT17細胞は、Notchリガンド発現ストローマ細胞の単層と共培養すると、DN2ステージ（CD44+CD25+c-kithi）から発生できることが示されている . 3141>

図3は、αβT細胞と同様にγδT細胞の分化過程をまとめたもので、αβ/γδTCRシグナルとSykファミリーキナーゼの要求の違いが強調されている。 分化の初期段階、すなわちαβT細胞系に対するβδ選択とγδT細胞系に対するγδ選択は、リガンド非依存性のプレTCRシグナルまたはγδTCRシグナルによって駆動され、それぞれ機能的TCR鎖またはγδTCR鎖を発現する細胞に対するチェックポイントとして機能している。 これらのリガンド非依存性受容体シグナルは、γδT前駆体を含むDN胸腺細胞で発現しているSykによって開始される。 γδT細胞系では、Sykを介したγδTCRシグナルは、PI3K経路の活性化を介してγδT17細胞の分化のプライミングにも必要である。 β-選択とγδ-選択の両方において、SykとZap70の発現は逆調節される。 Sykはダウンレギュレートされ、Zap70はプレTCRまたはγδTCRシグナルによってアップレギュレートされる。 したがって、αβT系統の分化の後期段階は、Zap70を介したαβTCRシグナルに依存し、これによりDP胸腺細胞はTEC表面のpMHCを認識し、αβTCR-pMHC相互作用の強さに応じて正または負に選択されるのである。 一方、内因性リガンドに応答するZap70を介したγδTCRシグナルは、γδT細胞のエフェクター機能を決定する：強いシグナルはγδT1を誘導し、弱い／無シグナルはγδT17を誘導するのである。