植物原料

Strychnos spinosa Lam.の葉とその抽出物は、抗菌力が強く細胞毒性が低い。 の葉を2013年1月にナイジェリアのザリア、サカラ村から採取した。 この植物体は，生物科学部（Ahmadu Bello University, Zaria）の植物園セクションの植物学者であるMusa Muhammadによって同定され，標本（No 900161）が預けられた。 収集した葉は、汚染のない換気室で乾燥させた後、Macsalab Mill (Model 2000 LAB Eriez) を用いて粉末にし、ガラス容器に入れ、室温（25±3℃）で暗所に保管した後、使用した。

抽出と液液分画

アセトン、メタノール、ジクロロメタン/メタノール抽出

スフネス&ドゥロスの方法のバリエーションを用いて、異なる葉抽出物に存在する成分を分画しました。 乾燥した葉の粉末（2 kg）をアセトン（6 l）で3回浸漬し、ろ過と真空での溶媒除去の後、アセトン抽出物（AcetE、75 g）を得た。 残渣を、上記のアセトン抽出について記載したのと同じ手順に従ってメタノール（6 l）中でさらに浸漬し、メタノール抽出物（MetE、119.2 g）を得た。 乾燥粉末葉の一部（1 kg）をまた、ジクロロメタン／メタノール（3 l）の混合物（1／1、v／v）で3回抽出し、ろ過および真空中での溶媒の除去後にジクロロメタン／メタノール抽出物（DcmMetE、114 g）を得た。 アセトン抽出物の一部（70 g）をクロロホルムと水の混合溶媒（1/1, v/v）で溶解・分画し、水およびクロロホルム画分を得た。水画分にn-ブタノールを加え、n-ブタノール（nButF, 25.1 g）および水（Wat1, 5 g）画分を得た。 クロロホルム画分を濃縮乾固し、10%メタノール水に溶解した後、ヘキサンで抽出した。 したがって、n-ヘキサンを加えた後、ヘキサン画分 (HexF, 23. 9 g) とメタノール中の10%水の残渣が得られた。 メタノール中の水の割合を増やして35%水メタノール成分を得た。最終的にクロロホルム (ChlF, 7.05 g) とクロロホルム添加後の35%水 (wat2, 2.8 g) フラクションが得られた。 比較TLCより、水(Wat1)と35%メタノール水(Wat2)画分を1つの画分(WatF, 7.8 g)にまとめた。

アルカロイド抽出

S. spinosaの葉（1 kg）をEtOAc-EtOH-NH4OHの混合液（96：3：1、v/v）（600 ml）で浸漬し、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて溶剤を除去した後、EtOAcで透析し、抽出物（26 g）を得た。 この抽出液をEtOAcに溶解し、4%酢酸で抽出し、EtOAc画分（EtAcF、20.02 g）を得た。 酸性溶液（pH 3-4）をNa2CO3でpH（8-9）に塩基化し、DCMで3回抽出し、真空中で溶媒を除去した後に粗アルカロイド抽出物（AlkE、2.8 g）を得た。

抗菌アッセイ

微生物および接種片の調製

用いた微生物は、3つのグラム陽性菌、Bacillius cereus（ATCC 14579）、Staphylococcus aureus（ATCC 29213）およびEnterococcus faecalis（ATCC 29212）、1つのグラム陰性菌、大腸菌（ATCC 25922）、である。 および酵母のCandida albicans、Cryptococcus neoformans（動物分離株）、Candida albicans（ATCC 10231）、糸状菌のAspergillus fumigatusの3種を含む真菌4種を用いた。 使用した真菌の一部は，獣医学部獣医熱帯病学教室において，動物の真菌感染症の臨床例から治療前に培養したものである。 C. albicansはGouldian finchから，C. neoformansはチーターから，A. fumigatusは全身性真菌症にかかった鶏から分離した。

細菌と真菌の培養は24時間培養した寒天プレートから行い，測定前に，真菌については新鮮なSabouraud dextrose broth (SDB) に，細菌についてはMueller-Hinton broth (MHB) (Fluka， Switzerland) に植え付けた。 微生物懸濁液の濁度は，細菌と真菌の濃度がそれぞれ1～5×108および1～5×107 cfu/mlに相当するMcFarland standard 0.5で調整した。 微生物懸濁液をさらに培地で希釈（1:100）し、細菌については約1.5×106 cfu/ml、真菌については約1.5×105 cfu/mlの最終接種量を得た。

最小発育阻止濃度測定

Masokoらによって修正された、テトラゾリウムバイオレットを微生物増殖の指標とする2倍連続微量希釈法により、抽出物と分画の細菌および真菌に対する最小発育阻止濃度（MIC）値を決定した。 .

A ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した100μl（10mg/ml）の抽出物および画分を96ウェルのマイクロタイタープレートに滅菌蒸留水で2倍に連続希釈し、MHBまたはSDBで新たに調製した微生物培養物100μlを各ウェルに追加した。 DMSO（5％）を陰性対照とし、ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンB（1 mg/ml）を陽性対照とした。 マイクロタイタープレートをビニール袋で密封し、37℃で24時間インキュベートした。 その後，0.2 mg/ml のp-ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（INT）40μl を各ウェルに加え，マイクロタイタープレートを37℃でさらにインキュベートした。 細菌は1時間および2時間後，真菌は16時間および36時間後に最小発育阻止濃度を測定した。 MICは、ホルマザンの赤色の強度の減少によって示される、微生物の増殖を阻害する最低濃度として決定された。 3404>

DPPH assay

抗酸化活性は、Du Toitらの記載に若干の修正を加えて実施した。 サンプルはHPLCグレードのメタノール（シグマ・アルドリッチ、ドイツ）に溶解し、抽出物および画分については1000〜7.81μg/mlの濃度範囲に、標準参照L-アスコルビン酸（シグマ、ドイツ）については40〜0.31μg/mlに2倍順次希釈されました。 簡単に言うと、40μlの（10mg/ml）試料を96ウェルマイクロタイタープレート（Bioster、スペイン）に導入し、メタノールで2倍に連続希釈した。 その後、2,2-ジフェニル-1-ピクリヒドラジル（DPPH）のメタノール溶液160μl（3.7mg/100ml）を各ウェルに導入し、室温、暗所で30分インキュベート後、マルチモードマイクロプレートリーダー（バイオテック、アメリカ）を用いて517nmの吸光度を測定した。 各試料および参照標準のフリーラジカル消去活性は、以下の式から求めた阻害率で求めた：

アブサンプルはDPPHを用いた抽出物の吸光度、アブブランクはDPPHを用いない抽出物の吸光度、アブコントロールはメタノールとDPPHの吸光度としています。 試料濃度に対して阻害率をプロットし、フリーラジカルDPPHを50％減少させる試料濃度（IC50）を決定した。 3404>

ABTS assay

抽出物および分画のABTSラジカル消去能は、Reらの方法に若干の修正を加えて測定した。 ABTSラジカル原液は、7mMのABTS溶液と2.45mMの過硫酸カリウム溶液を室温で12時間反応させ、734nmの吸光度を7.00±0.02に調整した後、使用した。 HPLCグレードのメタノール（Sigma-Aldrich, Germany）に溶解した抽出物または画分の溶液40μlをマイクロタイタープレートに導入し、15.62および2000μg/mlの濃度範囲にトウ倍連続的に希釈した。 トロロックス（シグマ、ドイツ）およびL-アスコルビン酸（シグマ、ドイツ）は、200から1.56μg/mlの範囲の濃度で調製された。 その後、160μlのABTS溶液をウェル（ブランクを除く）に加え、室温で6分間インキュベートした後、734nmで吸光度を測定した。 ポジティブコントロールとしてTroloxとアスコルビン酸を、ネガティブコントロールとしてメタノールを、ブランクとしてABTSを含まない抽出物または画分を使用した。 ABTS-+阻害の割合とIC50は、DPPHアッセイについて上記で報告したように算出した。

細胞毒性アッセイ

Veroサル腎細胞に対するアセトン抽出物とフラクションの細胞毒性を、以前に記載したように若干修正してMTT還元アッセイによって評価した。 96ウェルマイクロタイタープレートに1×105cells/ml（100μl）の密度で細胞を播種し、37℃、5％CO2の加湿環境でインキュベートした。 24時間培養後、細胞を含むウェルに最終濃度を変えたサンプル（100μl）を添加した。 ドキソルビシンはポジティブレファレンスとして使用した。 同濃度のアセトンを含む適切なブランクコントロールも含め、さらにプレートをCO2インキュベーターで48時間インキュベートした。 その後、各ウェルの培地を細胞から吸引し、PBSで洗浄し、最後に新鮮な培地（200μl）を各ウェルに添加した。 次に、30μlのMTT（PBS中5mg/ml）を各ウェルに加え、プレートを37℃で4時間インキュベートした。ウェルから培地を吸引し、DMSOを加えて形成されたホルマザン結晶を可溶化させた。 BioTek Synergyマイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定した。 各抽出物の細胞増殖阻害率は、細胞生存率を50％阻害する濃度と定義されるLC50値で表した。 選択性指数（SI）値は、細胞毒性LC50値をMIC値で割ることにより算出した（SI = LC50/MIC）。 試験は4重で行い、各実験は3回繰り返した。

統計解析

すべての実験は3重で行い、値は平均±標準偏差として表した。 数値間の差は分散分析を用いて有意性を評価し、結果は5%の有意水準でフィッシャーの最小有意差（LSD）を用いて比較した。