RESULTS

CEBPA Mutations Define a Subset of Normal Karyotype Acute Myeloid Leukemia with Favorable Prognosis（EBPA変異による予後良好な急性骨髄性白血病の定義）。 CEBPA遺伝子のヘテロ接合型変異は，正常核型のAML67例中12例（17.9%）で認められた。 この12人のうち8人（66.7％）は2つ以上のCEBPA変異が検出され、合計25個のCEBPA変異が同定された（表3）。

CEBPA mutations with the 12 patients have frame-shift mutations with truncation of the protein (Fig..). 1). 6名ではロイシンジッパードメインのCOOH-末端にin-frame挿入がみられた。 5人の患者では、合計10個の点突然変異が検出された。 2人の患者では、点突然変異が新規の停止コドンを作り出していた。 特に興味深いのは、患者7の212C > A点突然変異である（表3）。 この突然変異はアミノ酸21のセリンを除去している。 21番目のセリンのリン酸化はCEBPAの機能にとって重要であることが最近明らかになったが、この患者ではそれが失われている可能性が高い(26)。 トランスアクティベーション（黒棒）ドメイン1（79-97）とドメイン2（127-200）、およびベーシックジッパードメイン（278-358；黒棒）に対応するアミノ酸の位置。 42kDaおよび30kDaのタンパク質をコードするアミノ酸1および120のインフレーム開始コドン。 A、6つのNH2-末端変異体によってコードされるタンパク質。 変異体ペプチドは野生型CEBPA配列（白バーまたは黒バー）を含み、新規停止コドンで終結する前に新規ペプチドをコードする読み枠のシフト（斜線バー）が続いている。 B、4つの変異体は、新規の停止コドンをコードするCOOH-末端に位置するか（8と9‴）、フレームシフトとそれに続く新規停止コドンによる切断をもたらした（2と4‴）。 C、これら6つの変異体は基本ジッパードメイン内のインフレーム挿入であった。 D、 アミノ酸の変化を伴う点変異は4人の患者で見られた。

興味深いことに、CEBPA変異を持つ患者は、正常な核型と野生型のCEBPA遺伝子の状態を持つAML患者とは多くの点で異なっていた（表1）。 診断時の白血球数（WBC）は16.1対29.1G/Lと低い傾向にあった。 また、診断時の乳酸脱水素酵素（LDH）の中央値は、CEBPA遺伝子変異のない患者と比較して、CEBPA遺伝子変異のある患者では上昇していなかった（368対1074 units/L；P＝0.0150 ）。 また、イムノフェノタイピングの結果、CEBPA変異患者の50％（12人中6人）で白血病細胞がリンパ系マーカーであるCD7を発現していたが、CEBPA変異のない患者ではこのマーカーを発現しているものはなかった（表4）。 これは我々の知る限り、これまで報告されたことがない。 CEBPAの変異は骨髄芽球系のAML（M1、M2）に限られ、単球系（M4、5）、赤芽球系（M6）、巨核球系（M7）には見られないことが、我々や他の研究者によって以前に示されている（17-22）。

CEBPA mutationsがあるAML患者またはない患者において臨床経過は顕著に異なっていた． 導入化学療法後の完全寛解はCEBPA変異のあるAML12例すべてで達成されたが、変異のないAMLでは82％のみであった。 図2CおよびDは、表5にまとめたように、CEBPA変異のない患者は、CEBPA変異のある患者（33.5ヶ月；例えば45.5ヶ月）よりもDFS中央値（10ヶ月；P = 0.0017） およびOS（12ヶ月；P = 0.0007 ）が著しく短いことを示している。 正常核型でCEBPA変異を有するAML患者は、その疾患の経過が著しく良好であると結論付けた。

Internal Tandem Duplications of the FLT3 Gene Define a Subset of Normal Karyotype Acute Myeloid Leukemia with Particular Adverse Prognosis.Intermediate Duplication: Intermediate Duplications of FLT3 Geneは特に悪い予後を示す正常核型の骨髄腫のサブセットを定義する。 FLT3遺伝子のJMドメイン内のタンデム重複配列は，正常核型のAML67例中19例（28.4%）で検出された。 FLT3-ITD患者は、正常核型の他のAML患者とは様々な点で異なっていた（表1）。 診断時の白血球は、FLT3-ITD患者において高かった（38.6 G/L 対 17.6 G/L；P = 0.0298）。 また、診断時のLDH値の中央値は、FLT3-ITDを持たないAML患者と比較して、FLT3-ITD患者では著しく上昇していた（1,292対784 units/L; P = 0.0325 ）。 FLT3-ITDを有する患者と有しない患者のイムノフェノタイプに有意差は認められなかった（表4）。

FLT3-ITDを有する患者のAMLの経過は不利であった。 導入化学療法後の完全寛解達成率はFLT3-ITD患者と非患者で同等であったが（84％ vs 85％）、FLT3-ITD患者のDFS中央値は有意に短かった（8.0ヶ月 vs 12.5 ヶ月；P = 0.0328）。 また、FLT3-ITD を有する患者の OS は、FLT3-ITD を有しない正常核型 AML と比較して低下していました（10.1 ヶ月対 15.5 ヶ月、P = 0.0148）。 正常核型急性骨髄性白血病におけるBAALCの高発現は、予後不良と関連することが示唆された。 12人の健康なボランティアから得た末梢血白血球と骨髄細胞の間で、BAALC mRNAレベルに違いは検出されなかった。 図3Aは、全ボランティアのBAALCレベルを、末梢血の値をX軸に、骨髄の値をY軸に描いている。 相関係数（ピアソン）はr = 0.8507で、あるボランティアの血液と骨髄のBAALC mRNAレベルには強い相関があることが示された。 さらに、12人のボランティアのBAALC発現量の範囲は著しく小さかった（範囲、0.03と0.15、中央値、0.09）。 そこで、この12人の中央値0.09をカットオフ値とした。 したがって、0.09以上の値を「高発現」とみなし、0.09未満の値を「低発現」とした。

正常核型AML67人のBAALC発現レベルは0.004から67.2までであった。 67人中23人（34.3％）が「低」BAALC発現の基準を満たしたが，44人（65.7％）は「高」BAALC発現に分類された。 再び、ある患者について、血液と骨髄のBAALC mRNAレベルに相関があるかどうかを調べた。 実際、図3Bは、診断時に骨髄と血液の両方が得られた29人の患者の血液と骨髄のBAALCレベルの間に強い相関（r = 0.9501）があることを示している。 また、あるサンプル中の芽球の割合がBAALCの発現量と相関しているかどうかも評価した。 しかし、芽球の割合とBAALC発現量との間に相関は認められなかった（ピアソン相関、r = 0.0907）。

興味深いことに、BAALC発現量が高い患者は、診断時の白血球数および診断時のLDH値の中央値に関して、低い患者と有意差はなかった（表1）。 しかし、単芽球性サブタイプのAMLでは、以前の報告（24）と同様に、BAALCの発現が低い患者（80％；AML-M4およびM5 15例中12例）が優勢であることが確認された。 骨髄芽球性AML（M1およびM2）では、25.6％（43例中11例）しかBAALCの低発現が認められませんでした。 一方、骨髄芽球性AML（43人中32人、74.4％）および未分化AML（5人中5人）では、高いBAALCの発現が主に観察された。 また，M6およびM7亜型のAML（4名）では，すべてBAALCが高発現していた。

興味深いことに，BAALC発現の違いにより免疫表現型に有意差が検出された。 BAALCの発現が低い白血病細胞は、CD11b、CD15、ミエロペルオキシダーゼ抗原の発現が有意に高かった。 さらに、低BAALC発現は低CD34発現と相関していた（表4）。

導入化学療法後の完全寛解率は、高BAALC発現と低BAALC発現で差がなかった（82%対91%；P = 0.3008）。 しかし，BAALC高発現患者のDFS中央値は有意に短かった（8.5カ月 vs 21カ月；P = 0.0152）。 また、BAALC高発現患者の全生存期間は、BAALC低発現患者と比較して短縮した（10ヶ月対21ヶ月；P = 0.0210）。 要約すると、正常核型AMLにおけるBAALCの高発現は、DFSおよびOSの短縮と関連しているようである

In Fig. 図4では、全患者（左列；n＝67）、FLT3-ITDのみ（第2列；n＝19）、CEBPA変異のみ（中列；n＝12）、FLT3-ITDもCEBPA変異もない患者（第4列；n＝36）、最後に対照群（健康なボランティア12名）についてBAALC発現レベルのドットブロット表現を示している。 その結果、FLT3-ITDの患者さんでは、BAALCの発現量が広い範囲に及んでいることがわかりました。 FLT3-ITD患者において、BAALCの高発現と低発現は経過に差がなかったことから（データは示していない）、FLT3-ITDの存在はBAALC発現の重要性を上回ると結論付けている。 興味深いことに、CEBPA変異を有する患者は、「高」BAALC発現群に多くみられた。 CEBPA遺伝子変異を有する患者12名のうち、再発したのは3名のみであった。 驚くべきことに、これらの3人の患者は、CEBPA変異を有する正常核型AML患者12人のグループの中で最も高いBAALC発現を示した。 BAALC値の中央値（線）。 すべて、正常核型AML患者67人全員のBAALC値、FLT3、FLT3-ITD患者のグループ（n = 19）、CEBPA、CEBPA変異患者のグループ（n = 12）、w/o mut、FLT3-ITDもCEBPA変異もない患者のグループ（n = 36）、正常、健康ボランティア12名のBAALC値。

また、BAALC高発現群において、非常に高発現の患者（上位50%）のDFSまたはOSが高発現「だけ」の患者（下位50%）より短いかどうかを分析しました。 しかし、BAALC発現が非常に高い患者のDFSとOSは、BAALC発現が高い患者と差がなかった（それぞれ、P = 0.497、P = 0.757）。 同様に、BAALC低発現群においても、発現が非常に低い患者の臨床転帰が、発現が「低いだけ」の患者よりも良好であるかどうかを検討した。 ここでも、BAALCの発現が非常に低い患者は、BAALCの発現が低い患者とDFSおよびOSに差がないことが確認された（それぞれ、P = 0.753およびP = 0.746）。 これらの結果は、このカットオフが実際に予後良好な患者群と予後不良な患者群を分けるようであることを示し、我々のカットオフの有用性を支持した。

Low BAALC Expression in Normal Karyotype Acute Myeloid Leukemia with Neither CEBPA and FLT3-ITD Mutations Is Associated with Favorable Prognosis.The BAALC Expression in Normal Karyotype ACU は予後良好な患者群と関連し、正常な患者群と予後不良な患者群を分ける。 BAALCの発現は、FLT3-ITD変異もCEBPA変異もないAML患者のサブセット（67人中36人）で特に有用であろうと仮定した。 このサブグループの患者のBAALC発現の中央値は、我々の対照群の値の約10倍であった。 この36人のうち18人（50％）はBAALC発現が低く、18人はBAALC発現が高かった。

最も興味深いのは、これら2つのサブグループの臨床経過が、DFS（それぞれ18.4カ月と7.4カ月、P = 0.0001）およびOS（22.8と9.したがって、BAALCの発現は、これまでFLT3-ITDやCEBPA変異のような他のマーカーがなかった正常核型のAML患者において、特に重要な予後情報を付加すると結論づけられる。

最終的に、CEBPA変異、FLT3-ITD、BAALC発現が正常核型AMLにおける独立した予後マーカーとなるかどうかを調べるために多変量解析を行った。 この解析結果を表6にまとめたが、CEBPA変異、FLT3-ITD、BAALC発現は、正常核型AMLにおける独立した強い予後予測因子であるようだ。