TEST METHODS FOR PHOTOXICITY AND ANIMAL ALTERNATIVES

医薬品（20）や化粧品（21）に代表される、人が暴露する可能性がある化学物質の光安全性確保は重要である。 化学物質の光毒性の可能性を評価するために、in silico(22), in chemico(23), in vitroからin vivo試験まで、様々な試験方法が導入されている。 ROS生成などのin chemico試験（24）、3T3 NRU試験や3D表皮モデルなどのin vitro試験、モルモットやマウス、色素性ラットを用いたin vivo試験（25）が開発され、日常的に用いられている（2056）。 光毒性の光源は、被験薬に吸収される波長（吸収スペクトル）と光量（合理的な照射時間で達成可能）が光毒性を誘導するのに十分である必要があるため、極めて重要である（26）。 自然の太陽光を模擬したソーラシミュレータは理想的な人工光源と考えられている（図 5）

フィルター付きソーラシミュレータの照射パワー分布は、屋外の昼光に近いものが望ましいです。 ソーラシミュレータはキセノンアークまたは（ドープ）水銀-金属ハロゲン化物アークを装備しています。 また、細胞毒性の強いUVB波長を減衰させるために、適切にフィルターがかけられている必要があります。 これらのフィルター下で記録されるスペクトルは、標準的な屋外昼光から逸脱してはならない（Specification:

しかしながら、UVAランプのような他のUVA光源も、強度と波長を確認するために適切なUV線量計とともに使用することが可能です。 光強度（放射照度）は光源によって異なるため、光毒性試験の前に適切な広帯域紫外線計を用い て定期的に確認する必要がある。 UV-meterは各測定前に校正されている必要がある。 したがって，照射時間は光源の強度に依存する（例：1.7 mW/cm2 の光源では，5 J/cm2 を達成するために 50 分の照射時間が必要である）。 また、試験方法によっても照射時間は異なります。 5 J/cm2の照射量（UVA領域での測定値）は、細胞毒性はないが、3T3 Neutral red uptake assayにおいて光毒性反応を誘発する化学物質を励起するのに十分な強度があると判断された

3T3 Neutral red uptake assay. 3T3 NRU assayはOECDによって公式に承認され、2004年4月13日にOECD TG432として承認されました(3)。 この試験は、UV/VIS照射の有無にかかわらず、被験物質を曝露した後の細胞生存率の相対的な減少を測定することにより、光細胞毒性を評価するものである。 3T3 NRU光毒性試験は、適切な溶媒に溶解したときにUV/VIS領域に吸収スペクトルを示す化学物質について実施することが決定されている（17）。 モル消光/吸収係数が10 litre x mol-1 x cm-1未満であれば、その化学物質は光反応性を示さないと示唆されている（例：光路長1 cmのUVキュベットにおいて、0.05 M溶液のODは「吸光度＝消光係数×光路長×濃度」式に基づき、非光反応性とみなされる0.5未満でなければならない） (26)． 3T3 NRUテストは高感度であるが、特異的な予測能力は低い（感度93％、特異度84％）。 3T3 NRU試験には多くの限界がある。 光毒性、光アレルギー（光感作）、光発がん性など、化学物質と光の複合作用に起因する光（細胞）毒性以 外の有害作用は予測できない。 3T3 NRU試験はハザード判定のみに用いられ、光毒性評価への有用性は保証されていな い。特に、この試験系は全身に曝露された化学物質の発現に重要な代謝活性を欠く。 したがって、モノクロタリン、リデリン、ヘリオトリン（ピロリジジンアルカロイド）（28） のように代謝活性化を必要とする全身曝露化学物質については、in vivo動物試験を推奨する（5,29）。

3T3 NRUの基本的な試験原理は、細胞膜を容易に透過し、細胞内のリソゾームに蓄積する弱カチオン性色素であるバイタル色素、ニュートラルレッドを用いて、UV/Vis照射の有無による細胞生存率を比較するものである。 ベースとなる細胞株は、1968年にG.T. Todaroがマウス胚から開発したマウス繊維芽細胞であるBalb/c 3T3細胞である。 3T3とは、20cm2ディッシュで3日間培養し、3×105個の細胞を接種することを意味し、比較的安定で、入手しやすく、取り扱いが容易な細胞である(30)。 皮膚線維芽細胞は光毒性の標的細胞の一つであり、3T3細胞の使用に強固な根拠を与えている。

3T3 NRUアッセイにおいて被験物質の光毒性の有無を決定するには、照射の有無による濃度反応性を得なければならない。 光刺激性因子（PIF）あるいは平均光効果（MPE）を算出するものとする（31）。 PIFは、図7に示すように、非照射と照射のIC50（細胞生存率が50％低下する濃度）の比である。

IC50が得られない場合、MPEを以下の式で算出します

PIF < 2またはMPE < 0.1 で予測される。 「光毒性はない」と予測されます。 PIF > 2 and < 5 or MPE > 0.1 and < 0.15 は「光毒性なし」と予測される。 光毒性の可能性が高い」、PIF > 5またはMPE > 0.15は「光毒性がある」と予測する。 「

赤血球溶血試験。 細胞膜は光化学的に生成された活性酸素やラジカルに対して脆弱です。 UVAによる赤血球の損傷とそれに伴う溶血（光溶血）は、被験物質の光毒性ポテンシャルを評価するために利用されている（32）。 ヒツジ赤血球（SRBC）を化学物質とともにインキュベートし、20 J/cm2 のUVAを照射する。 照射後、SRBCは暗所で室温2時間、さらに37℃で1時間インキュベートした後、Drabkinの試薬で溶血を測定し、540 nmでのUV吸光度を測定した。 光毒性の程度は、SRBCからのヘモグロビンの遊離、すなわち光溶血活性により、式(33)に従って評価した。 オブジェクト名は、toxicr-31-97-e101.jpg

• ADE：赤血球を含む曝露薬液の光学密度

• AD：赤血球を含まない曝露薬液の光学密度

• C: 100%溶血対照液の光学濃度

シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシンなどの光毒性物質は100μg/mLで光溶血活性を20%を超えて著しく増加させる。 本試験の感度，特異性，精度は，in vivoモルモット試験（34）と比較して，24化学物質（香料8，紫外線吸収剤5，医薬品4，抗菌剤4，染料3）についてそれぞれ67%，73%，73%であった。 しかし、感度が低く、3T3 NRU試験より性能が劣るため、近年、利用が減少している。

In vitro human 3D epidermis model. 2177 ＜2177＞In vitroヒト3D表皮モデル in vitro細胞法の限界を克服するため、3D表皮モデルを光毒性試 験に適用することが検討されている（35,36）。 基本的に試験原理は3T3 NRU試験と同様であり、UV/VIS照射の有無による組織生存率の差の評 価である。 PIFとMPEを用いた同様の予測モデルを利用することも可能である(37)。 一方、3次元表皮モデルでは、水に溶けない物質を試験することができ、表皮層の初代ケラチノサイトにある程度の代謝能力が保持されているため、代謝活性化を必要とする毒性物質への応用が期待される(38)。 また、IL-1β（Interleukin-1β）（39）のようなサイトカイン産生の測定、コメットアッセイ（40）、組織学的検査も可能で、光アレルギー性や光発がん性のさらなる評価に考慮することができます

In vivo法 モルモット、マウスまたは色素性ラットを使用します。 マウスやモルモットなどの実験動物は、ヒトの光毒性の実生活におけるシナリオをシミュレ ートするために使用されている。 動物に化学物質を局所的あるいは全身的に曝露し、適切な量のUVA（モルモット試 験では通常10 J/cm2、マウス試験では20 J/cm2 (41)）を照射する。 紅斑と浮腫を 0～4 点で採点し、72 時間観察したときの最高点を動物ごとに平均し、刺激性指標を算出する。 光毒性指標は「UVA照射部位の刺激性指標-非照射部位の刺激性指標」(42)の式で求められる。 光毒性指数が0.6を超えると、光毒性の可能性があることを示す。 あるいは、マウス試験において耳の厚さを測定し、浮腫を推定することもできる。 これらのin vivo試験はヒトにおける光毒性の病態生理をよく反映しているが、動物 の犠牲、試験実施に要する経費や時間は、特に動物福祉や倫理が広く認識される時代にあって は、多くの問題を提起している。 このような問題を克服するために、動物を用いない光毒性試験 が最近人気を集めている（43）。 無細胞試験管法、すなわちインケミコ法は、光毒性の評価法として検討されている。 試験品の吸光度や光安定性に関する情報を分析し、光毒性の予測を行っている（44）。 光励起とそれに続く光反応における活性酸素種の生成を利用して、化学物質の光毒性を in chemicoで評価することができる（12）。 一重項酸素の検出にはp-ニトロソジメチルアニリン（RNO）漂白法が、過酸化物の生成にはニトロブルーテトラゾリウムテスト（NBT-ホルマザン反応）が用いられており、以下のように考えられている(24)。

• 一重項酸素＋イミダゾール

• →酸化イミダゾール

• + RNO

• → RNO漂白＋製品

ROS発生アッセイは感度90％と特異性76％を示し、またRNO漂白＋製品の感度も70％と特異性70％を示しました。9%、化粧品以外の化学物質では100%と75%であった。 DNA鎖切断活性は、開環または閉環DNAを定量することにより、化学的に異なる種類の化学物質や薬物の紫外線誘発光毒性を評価する別の方法である。 このアッセイも生きた細胞や組織を必要とせず、プラスミドを用いる。 プラスミドをバッファーに溶かし、試験品と混合する。 紫外線を照射した後、電気泳動する。 破断したDNAの量は蛍光法で分析する。 紫外線による光毒性化合物のDNA鎖の切断は、薬剤の濃度と紫外線照射量に依存する(33)。 これらの検査では、検査結果のばらつきを助長する生細胞や組織を必要としない。 しかし、代謝活性化能がないこと、水に不溶な物質（油、固体、ゲル、製剤）には適用できないこと、光遺伝毒性、光アレルギー（光感作）、光発がん性を予測できないことなどの制限がある。 この試験はハザードの特定に限定され、光毒性効力の評価には使用されない

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