Genome-wide systematic characterization of bZIP transcription factors and their expression profiles during seed development and in response to salt stress in peanut
Identification, phylogenetic analysis and group classification of bZIP genes in A. All Rights Reserved. duranensis and A. ipaensis
相同性検索とドメイン検証により、A. duranensisとA. ipaensisゲノムからそれぞれ50個と45個のユニークなbZIP遺伝子が同定された。 これらの遺伝子について、遺伝子ID、ゲノム上の位置、ドメイン構成、グループ分類などの詳細を、Additional file 1に記載した。 既存の命名法に従って、これらの新規bZIP遺伝子にそれぞれ固有の名前を付けた。 AdbZIP1-50 と AibZIP1-45 と命名した。 bZIPドメインを調べた結果、93の遺伝子は、基本領域に不変のN-×7-R/Kモチーフと、C末端に向かってR/Kのちょうど9アミノ酸上流に位置するLeuのヘプタッドリピートを含む典型的なbZIPドメインを持っていた（追加ファイル2）。 残りの2つのbZIP遺伝子、AdbZIP28とAibZIP22は、基本領域において、保存されたArg/Lys（R/K）がIIe（I）に置換されているという、珍しい置換があった。 この置換は他の生物種でも報告されている。
bZIP遺伝子ファミリーの系統的な調査は、まずシロイヌナズナで行われた。 この解析では、bZIP遺伝子の異なるグループを区別し、その系統関係と機能的分岐に基づいて命名された。 この分類法は、その後、他の生物種においても、その生物種やシロイヌナズナゲノムから得られたbZIP遺伝子のクラスタリングに基づいて採用されています。 ここでは、アラキス・シロイヌナズナゲノムから得られたbZIPタンパク質の最尤法解析に基づき、11の異なるbZIP遺伝子クレード（グループA-I、S、U）を同定し、いずれも高いブートストラップサポートを得ている（図1）。 アラキスのbZIPのサブグループ分類は、ダイズ由来のbZIPを加えて系統樹を再構成することでさらに確認された（追加ファイル3）。 ほとんどのbZIPクレードは、近縁のArachis bZIPとそのシロイヌナズナオルソログを含んでおり、クレードEとFはA. duranensisとA. ipaensisには対応するメンバーがいない。 注目すべきは、同じクレード内のbZIP遺伝子は、エキソン/イントロン構造、イントロンの位相、MEMEモチーフ、結合部位構造の予測（以下でさらに分析）など、グループ特有の配列特性を共有していることである。 このような種間グループのクラスタリングのパターンから、グループ特異的な特徴は、アラキスとシロイヌナズナの分岐以前に出現したことが示唆された。 しかしながら、異なる植物種のbZIP遺伝子にも、進化の過程でいくつかの違いが蓄積されている。
ピーナッツとシロイヌナズナのbZIP遺伝子の系統分析。 異なる種からの枝先の遺伝子は、異なる色の三角形で示されている。 ピーナッツのbZIPタンパク質は、9つの異なるクレード（A-D、G-I、S、U）に分類される。bZIPタンパク質配列はClustalXで整列し、PhyMLで最尤法により系統樹を作成した。 ブートストラップ値は100回繰り返しによる
Gene structure of Arachis bZIP genes
イントロンとエクソンの構成はbZIP遺伝子の進化の軌跡を示しているかもしれないから、我々はアラキスのbZIP遺伝子についてイントロン数、長さとスプライシング相などの構造を調べた（付加ファイル4）。 その結果、同じ系統群に属するArachis bZIPは、全体的に同一または類似の遺伝子構造を持つことが分かった。 イントロンを持つ遺伝子では、AdbZIPとAibZIPのイントロン数は1〜13であり、G群のbZIPが最も多く、他のマメ科植物のゲノムと一致した。
スプライシングの位相は、コドンの3番目のヌクレオチドの後にスプライシングが起こるフェーズ0（P0）、コドンの最初のヌクレオチドの後にスプライシングが起こるフェーズ1（P1）、2番目のヌクレオチドの後にスプライシングが起こるフェーズ2（P2）の3つに指定された。 オープンリーディングフレーム（ORF）内のスプライシング部位の位相は多様であったが、bZIPドメインの基本領域とヒンジ領域では、これらの領域に変化があればそのコードと機能に影響が出るため、高度に保存されていた。 イントロンの位置とbZIPドメイン内のスプライシング相の有無や数から、アラキスのbZIP遺伝子には4つのイントロンパターン（a〜d）があることがわかった（図2、追加ファイル2）。 パターンaはヒンジ領域の-5位、アミノ酸GlnとAlaの間にイントロンが1つだけ挿入されたもので、A群、G群の全てのArachis bZIP遺伝子で確認された。パターンbはフェーズ0のイントロン挿入が2つ、一方は基本領域、もう一方はヒンジ領域にあり、D群の全てのbZIP遺伝子で確認された。 パターンcは、第2相（P2）で基本領域の-20位に1つのイントロンが挿入されており、グループCとHの全てのbZIP遺伝子を含んでいる。パターンdは、基本領域とヒンジ領域にイントロンがなく、グループBとSの全てのbZIP遺伝子を含んでいる。また、パターンdを示すアラキスのbZIPは、AdbZIP45とAibZIP40を除いてほとんどがイントロンレスであることが確認された。 これらの遺伝子は、基本領域とヒンジ領域の外側にそれぞれ1つずつイントロンを持っていた。 今回観察されたアラキスのbZIPドメインにおけるスプライシング位相のパターンは、他の種で観察されたパターンと一致した。 5555>
Arachis bZIPドメインの基本およびヒンジ領域内のイントロンパターン。 bZIPドメインの一次構造は画像の上部に示されている。 P0はイントロンスプライシング部位がコドン間にあることを示し、P2はイントロンスプライシング部位がコドンの2番目と3番目のヌクレオチドの間にあることを示している。 イントロンの発生率、イントロンの位置、スプライシングの位相に基づき、アラキスのbZIP遺伝子は4種類のパターンを示した（a-d）。 ピーナッツbZIPタンパク質のbZIPドメイン内のイントロン位置の詳細は、Additional file 2
The motif compositions for different groups of Arachis bZIPs
bZIP domainに加えて、MEME analysis toolにより、多くの追加の保存モチーフがbZIP遺伝子に検出された。 図3に示すように、bZIPドメイン以外の保存モチーフが合計18個同定され、各サブグループのコンセンサスモチーフ組成が構築された（Additional file 5）。 これらのコンセンサスモチーフは、同じサブグループ内ではモチーフの全体的な構成が似ているが、異なるグループ間では異なっていることが示された。 このことから、bZIP遺伝子の機能的分岐はグループ特異的なモチーフによって決定されている可能性が示唆された。 これらのモチーフを個別に検討した結果、多くのモチーフがグループ特異的であることがわかった。 例えば、モチーフ1、2、3、10はグループDで、モチーフ5、14、15はグループGで、モチーフ6はグループIで、モチーフ9はグループHでそれぞれ同定され、いくつかのモチーフは特定の生体機能に関連していると思われた。 例えば、モチーフ1はDELAY OF GERMINATION (DOG) 1ドメインであり、ABAシグナル伝達成分に干渉することによって、休眠の誘導と種子の成熟の様々な側面に必要である。 モチーフ3はカゼインキナーゼII (CK II) のリン酸化部位 (S/TxxD/E) を持ち、細胞分裂と増殖に重要な役割を果たすとともに、多様な発生・ストレス応答経路に影響を与える。 興味深いことに、これらのグループ特異的なモチーフは、他のマメ科植物ゲノムの同じグループのbZIPでも同定されており、モチーフの構成がマメ科植物間で保存されていることが示唆された。
MEMEにより同定した追加の保存モチーフの分布． ピーナッツbZIPタンパク質の各グループのモチーフ組成を、bZIPドメインとbZIPドメイン外の追加保存モチーフの位置に基づいて示す。 bZIPドメインは赤で、その他のモチーフは1〜18の番号のついた色のついたボックスで強調されている。 また、bZIPドメイン以外の保存されたモチーフは1〜18の番号で色分けされている。 その結果、bZIPドメインに存在するアスパラギン（Asn/N、位置：-18）とアルギニン（Arg/R、位置：-10）という2つの不変の部位の置換によって、DNA結合の特異性が変化していることがわかった。 我々は、ピーナッツbZIPタンパク質の基本領域とヒンジ領域のアミノ酸配列をアラインメントし、それぞれのグループ内で保存されたアミノ酸残基と多型を同定した（Additional file 6）。 ピーナッツbZIPでは、-18位のAsn/Nの置換は観察されなかった。 しかし、グループIの全メンバーは-10位にアルギニン（R）の代わりにリジン（Lys/K）を有しており、他のマメ科植物由来のグループI bZIPと一致した。 さらに、AdbZIP28とAibZIP22（グループU）はアルギニン（Arg/R）の代わりに疎水性のイソロイシン（Ile/I）残基を持っており、このような置換は酵母のAP1に対するbZIPの親和性を完全に阻害し、イネのGボックスを認識しないことが実証された。
Leu zipper配列はbZIP蛋白質のホモおよび/またはヘテロ二量体化を仲介し、DNAと二量体で結合することが知られている . Leuジッパー領域はヘプタッド反復配列からなり、各ヘプタッド内のアミノ酸はa, b, c, d, e, f, gと呼ばれている。 a, d, e, g の位置のアミノ酸は Leu ジッパー界面に近いため、これらのアミノ酸は主に Leu ジッパーのオリゴマー化、二量体化の安定性、二量体特異性を決定するアミノ酸であると考えられる。 我々はピーナッツbZIPのa、d、e、g位に見られるアミノ酸の組成を分析した（図4a）
アラキスのbZIPタンパク質における二量体化特性の予測。 a Arachis bZIPドメインのLeu zipperの4つの位置（a、d、e、g）それぞれに様々なアミノ酸の頻度を示す円グラフ。 b 全てのArachis bZIPタンパク質にわたるLeu zipperのa位置のAsn（N）の頻度を示すヒストグラム。 c 全てのArachis bZIPタンパク質にわたるヘプタッドごとの引力または反発するg/Reの組合せの頻度を示すヒストグラム。 g↔e′ペアはgとeの位置の静電荷によって4つのグループに分類される。 オレンジ色のボックスで示される+/-の引力は、gの位置が塩基性で、次のeの位置が酸性であることを示す。 水色の枠で示した-/+引力は、g位が酸性で、その次のe位が塩基性であることを示す。 塩基性反発（ピンクのボックス）と酸性反発（緑のボックス）は、g位とそれに続くe位が同じような電荷を持ち、両方とも塩基性か両方とも酸性であることを示す
a位では。 この残基は疎水性界面に極性ポケットを形成することができ、他のアミノ酸と比較して、a↔a（反対側のらせんの対応する位置）においてより安定なN-N相互作用を可能にする。 異なるヘプタッドにおいて、2番目と5番目のヘプタッドでは、aの位置のAsn/N残基の頻度が最も高かった（それぞれ61.46%と60.22%；図4b）。 d位置（Fig. 4a）では、ピーナッツbZIPの45%にLeuが含まれており、脂肪族アミノ酸の中でも最も二量体を安定化させるアミノ酸の一つである。 e位置では、ピーナッツbZIPの37%が酸性アミノ酸DまたはEを持ち、g位置では、ピーナッツbZIPの44%が塩基性アミノ酸RまたはKを持っていた (Fig. 4a)。 これらの帯電したアミノ酸は、静電的相互作用でヘリックス間に塩橋を形成すると考えられている。 また、引力または斥力のあるg↔e′静電相互作用は、二量体化の特異性と安定性に影響を与えるヘリカル間の塩橋を形成することができる . アラキスのbZIPタンパク質の二量化特性を支配するeとgの位置の荷電残基の寄与を調べるために、各ヘプタッドにおける引力と斥力のg↔e′ペアの頻度を計算した（図4c）。 全てのヘプタッドにおいて、魅力的なg↔e′ペアは第2ヘプタッド（15.6%）、第5ヘプタッド（35%）、第6ヘプタッド（30%）に集中しており、これらは完全な魅力的g↔e′相互作用を形成しヘテロダイマーの相補性によって安定化に貢献することができることが示された。 28のサブファミリーからなる3つのグループ（BZ1-BZ28）は、ホモおよびヘテロ二量化特性、特に二量化特異性に基づいてさらに分類された（追加ファイル7）。
The impact of whole genome duplication and tandem duplication on expansion of Arachis bZIP gene family
A. duranensis and A. ipaensisゲノムにおけるゲノム全域に跨る重複ブロックと二つのゲノム間で正対する重複ブロックが確認された。 共リニアブロック内のパラログとオルソログ間の対同義語距離（Ks値）を計算し、その頻度分布をプロットした（図5a；Ks bin = 0.05）。 A. duranensisとA. ipaensisの間のKs頻度のピークは、平均的な配列変動を表し、0.035であった。 これは、この2つの近縁種間の配列分岐を表しており、216万年前に分岐したと推定される。 さらに、A. duranensisとA. ipaensisのパラログのKsピークはそれぞれ0.90と0.95であり、これは5800万年前に起こった初期のパピリオロイド全ゲノム重複（WGD）イベントの配列分岐に対応するものだった
Whole genome duplication (WGD) -derived Arachis bZIP genes. a WGD由来の重複ゲノムブロックからのパラログのKs分布はA. b WGD由来の重複したbZIPパラログを青線（A. duranensis）および緑線（A. ipaensis）で連結した。 A. duranensisとA. ipaensisのbZIPオルソログは、読み取り線
で結ばれ、重複するゲノムブロックに関与する35個のAdbZIPと32個のAibZIPを検出し、それぞれの種のbZIP遺伝子の約70% (35/50) と71% (32/45) を占めた（図5bと追加ファイル8）。 さらに、重複したbZIP遺伝子対は、染色体内または染色体間に存在し、その中には1回、2回、3回とセグメント的に重複しているものがあった。 この結果は、WGD後に遺伝子が優先的に保持され、頻繁に染色体が配置されることを示している。 また、A. duranensisでは2組の遺伝子（AdbZIP33/AdbZIP34とAdbZIP41/AdbZIP42）、A. ipaensisでは1組の遺伝子（AibZIP28/AibZIP29）にしかタンデム重複が検出されなかった。 このことから、bZIP遺伝子ファミリーの拡大において、タンデム重複はほとんど起こらず、セグメント重複よりも重要でないことが示唆された。 また、系統解析とシンテニック解析により、A. duranensisとA. ipaensisの間で35組のbZIP遺伝子のオーソログを同定した。 これらの遺伝子は4倍体ピーナッツの2つのサブゲノム間でもホメオログであった。
アラキスのbZIP遺伝子に働く進化的制約を理解するために、2種のアラキスで重複するbZIP遺伝子対ごとにKa/Ks値を計算した（追加ファイル9）。 これらのペアワイズ比較のほとんどで、Ka/Ks値は0.5未満であった（重複するAdbZIP間のペアワイズ比較が1つだけ、重複するAibZIP間のペアワイズ比較が2つだけ0.5以上であった）。
ピーナッツ種子形成過程におけるArachis bZIP遺伝子の発現解析
bZIP遺伝子の発現をプロファイルするために、我々は以前発表したピーナッツ種子の異なる形成段階での遺伝子発現を記録したRNA-seqデータを使用した。 このデータは、開花後20日、40日、60日という異なる発生段階におけるピーナッツ種子の遺伝子発現を記録したものである。 このデータを用いて、すべてのArachis bZIPのFPKM値と、3つの発生ステージで差次的に発現したすべてのbZIPを同定しました。 どの発生段階でも発現していない24のbZIPを除いて、特異的な発現プロファイルを持つ対応するbZIP遺伝子を含む4つのグループが認識された（図6aおよび追加ファイル10）。 最初のグループは、発生初期（20 DAF）に発現が増加し、その後（40および60 DAF）に発現が減少する37のbZIPから構成される。 第二のグループは、40 DAFで発現が増加した15個のbZIPからなり、第三のグループは、40 DAFで発現が減少した17個のbZIPからなる。 第4のグループは、3つの発生段階のすべてで高発現している22のbZIPで構成されていた。 これらのbZIPのいくつかは、シロイヌナズナ、イネ、トウモロコシなど、他の植物の種子形成に関与している遺伝子と相同性を有していた。 そこで、高発現している12個のbZIPを選び、qRT-PCRで確認したところ、RNA-seqで決定した発現パターンがqRT-PCRで判明したものと一致していました（Fig. 5555>
Arachis bZIP gene expression during peanut seed development. a 特定の発現プロファイルに対応するbZIP遺伝子を含む4群（I〜 IV群）が認識された。 各グループにおいて、灰色の線はDAF20、DAF40、DAF60におけるbZIPの発現量を示している。 赤線は全bZIP遺伝子の平均FPKMを示す。 b 種子形成期に発現する12個のbZIP遺伝子をqRT-PCRで検証した。 qRT-PCR（オレンジ色のヒストグラム）およびRNA-seq（青色の線）で測定された相対的な遺伝子発現レベルを示す。 結果は3つの生物学的複製に基づく；エラーバーはSEを表す。 c 種子形成中のbZIP A. duranensisおよびA. ipaensisのオルソログの発現パターン。 A群では、AdbZIP33とAibZIP28は、シロイヌナズナやマメ科植物のABAシグナルや種子形成・寿命の制御に関わるArabidopsis ABA insensitive 5（ABI5）とオルソログを形成していた。 RNA-seq と qRT-PCR の結果、4 倍体ピーナッツの 2 つのサブゲノムに由来する ABI5 のオーソログコピーはともに発生時に高発現しており、これらの遺伝子の機能はピーナッツとシロイヌナズナで類似している可能性が示唆された。 また、qRT-PCRの結果、グループA遺伝子であるAdbZIP42、AdbZIP48およびAibZIP31が発生過程で安定に発現していることが示された（図6bおよび追加ファイル11）。 これらの遺伝子は、ABA を介した種子の発生、発芽、胚の成熟に関与する ABFs および AREB と相同性がある。 また、グループCの3つの遺伝子（AdbZIP23、AdbZIP37、AibZIP30）も高発現しており、トウモロコシのbZIP因子Opaque2と相同であることがわかった。 Opaque2 は、トウモロコシ種子におけるタンパク質蓄積やアミノ酸・糖代謝を制御している。 さらに、ピーナッツ種子では、グループS遺伝子であるAibZIP10、AdbZIP12、AdbZIP24、AdbZIP26、AdbZIP36が極めて高い発現を示した（図6bおよび追加ファイル11）。 興味深いことに、グループS遺伝子AdbZIP24とAdbZIP36は、グループC遺伝子AdbZIP37とAibZIP30と同様の発現パターンを示した：種子の発達が進むにつれて発現レベルが減少する。
次に、4倍体ピーナッツのAAゲノムとBBゲノムからのホメオロジー遺伝子間の遺伝子発現における分岐をさらに調査した。 ヒートマップ解析の結果、AAゲノムとBBゲノムのホメオログ／オルトログ遺伝子31組について、種子発生に伴う全体的な発現パターンが類似していることが示された。 これらの遺伝子対の間の遺伝子発現の差を各サンプルについて統計的手法と組み合わせて差分発現解析法を用いて算出した。 その結果、20DAFにおいて3組の遺伝子（AdbZIP5とAibZIP5、AdbZIP17とAibZIP15、AdbZIP46とAibZIP41）が、3組の遺伝子（AdbZIP3とAibZIP1。 40DAFではAdbZIP4とAibZIP4、AdbZIP49とAibZIP45）、60DAFでは5組（AdbZIP3とAibZIP1、AdbZIP33とAibZIP28、AdbZIP37とAibZIP30、AdbZIP10とAibZIP10、AdbZIP1とAibZIP3）である。 この結果は、2つのゲノム間で全体的に発現が保存されていることを示すが、20%の遺伝子は2つのゲノムの並行進化と多倍体化の間に発現が分岐したことを示唆した（図6c）。
qRT-PCR expression profiles of Arachis bZIP genes under salt stress
qRT-PCRを用いて、bZIP遺伝子発現が塩処理に対してどのように変わるか調べた（図7および追加ファイル12）。 PCRでは4つのbZIPを明確に増幅することができなかった。 ピーナッツの根を1時間塩処理した後、20の遺伝子が有意に差次的に発現した；5時間後、27の遺伝子が有意に差次的に発現した；そして10時間後、41の遺伝子が有意に差次的に発現した（図7j；Studentのt検定：P < 0.05）。 各時点で、多くの遺伝子が発現低下よりも発現上昇した（1時間後：14対6、5時間後：21対6、10時間後：34対7）。 塩処理後に発現量の異なるこれらのbZIPのうち、多くはA群とS群に分布しており（図7k）、これらの群のbZIPは糖シグナルと生物的ストレスの制御に重要な役割を担っていることが示された。
Arachis 0、1、5、10時間の塩処理後のピーナッツ根のbZIP遺伝子発現レベル。 *: P < 0.05. j 各群で有意に発現量の異なるbZIP遺伝子の数 k 塩処理1、5、10時間後に有意に発現量の異なるbZIP遺伝子の数
グループAのbZIPはストレスやABAシグナルに関わるCKIIやCa2 +依存性プロテインキナーゼリン酸化部位モチーフを持ち、これらのモチーフは様々な生物環境ストレスに対する植物の適応に重要である． 実際、多くのグループA遺伝子が塩ストレス応答と関連している。 シロイヌナズナでは、ABI5とABF/AREBがABA依存性のシグナル伝達因子として、生物学的ストレス耐性に関与している。 GhABF2の過剰発現は、シロイヌナズナおよびワタにおいて塩ストレス耐性を顕著に向上させた。 トマトでは、slAREB1 および slbZIP1 をノックアウトすると塩ストレス耐性が向上し、slAREB1 および slbZIP1 を過剰発現させると塩ストレス耐性が低下した。 また、AdbZIP42 と AibZIP35 は塩ストレスに対して有意に発現が上昇し、これらの遺伝子は ABFs, GhABF2, slAREB1, slbZIP1 と相同性があることが明らかになった。 また、これらの遺伝子はABA活性化SnRK2プロテインキナーゼによってリン酸化されることが報告されており、ABA応答要素結合因子のリン酸化がABAによる塩ストレス応答に重要である可能性がある。
Bグループの遺伝子AdbZIP45とAibZIP40は10時間の塩ストレス後に発現が増加し、これらの遺伝子はAdbZIP17とホモロジーであり、いくつかの塩ストレス応答遺伝子はアラプシスの発現量を改善できることがわかった。 7 つのグループ G bZIP 遺伝子（AdbZIP7, AdbZIP15, AdbZIP19, AdbZIP50, AibZIP17, AibZIP21, AibZIP38）はシロイヌナズナの AtbZIP41 およびトマトの slbZIP38 と相同性があり、これらの遺伝子は共に 塩ストレスを負に制御することが明らかにされてきた . これら 7 遺伝子のうち，AdbZIP15 は塩ストレス処理 1 時間後および 5 時間後に有意に低下し，AdbZIP19 および AibZIP17 は塩ストレス 10 時間後に有意に上昇した。 したがって、AdbZIP15, AdbZIP19, AibZIP17 は塩ストレスに対する抵抗性を付与している可能性があ る。 また，AdbZIP15はslbZIP38と塩ストレスに対する発現パターンが類似していたことから，塩ストレスに対するネガティブレギュレーターである可能性が考えられた。
S群遺伝子AdbZIP24とAdbZIP36はAtbZIP1, AtbZIP53, MtbZIP2, MtbZIP26と相同であり，これらの遺伝子は塩ストレスに対して同様の発現パターンとなっていた(Fig. 7). 特に，AdbZIP36は塩ストレス10時間後に有意に発現が増加した。 シロイヌナズナの2つの相同遺伝子、AtbZIP1とAtbZIP53は、根が塩ストレスに適応するために、一次糖質およびアミノ酸代謝を再プログラムすることが明らかにされた . また、ホモログのMtbZIP2およびMtbZIP26も塩処理により転写誘導され、塩ストレスに対する植物の耐性を向上させることがわかった . 特に，AdbZIP36 の発現パターンは，シロイヌナズナおよび M. truncatula の AtbZIP1， MtbZIP2 および MtbZIP26 と類似しており，AdbZIP36 がピーナッツの塩ストレス耐性の正の調節因子である可能性が示唆され た。 以上のように、今回の発現解析により、塩ストレス応答と関連する可能性のあるピーナッツのbZIP候補をいくつか見出し、今後の研究ターゲットとした
。