Fertile offsprings from sterile sex chromosome trisomic mice
Trisomic animals lose third chromosome
一般に哺乳類の性染色体は、通常の2本に3本目が加わる（雌はXX、雄はXY）と発生異常が生じますが、トリソミックマウスは、この3本の染色体のうち1本が不妊の子供です。 性染色体がトリソミックのマウスは不妊症である。 広田らは、染色体トリソミーXXYまたはXYYを持つ不妊マウスの細胞を再プログラミングすると、XY幹細胞が生成されることを実証している。 このXY幹細胞から生成された精子は、健康で生殖能力のある子孫を生み出すことができた。 969>
Science, this issue p. 932
Abstract
正しい数の染色体を持つことは、通常の発達と健康にとって不可欠である。 性染色体トリソミーはヒトの0.1%が罹患しており、不妊症と関連している。 我々は、人工多能性幹細胞（iPSC）への初期化の際に、トリソミーXXYおよびXYYマウスの線維芽細胞が、トリソミーバイアス染色体損失（TCL）と呼ぶ現象によって余分な性染色体を失うことを示す。 その結果、XY型iPS細胞は雄の生殖細胞系に分化し、機能的な精子を得ることができます。この精子を用いて、染色体的に正常な、生殖可能な子孫を残すことができるのです。 マウスXXおよびXY iPSCの作製において、性染色体の損失は比較的まれである。 TCLは他の染色体にも適用され、ダウン症マウスの細胞から倍数体iPS細胞を作製することができます。 また、ヒトのトリソーム患者の線維芽細胞から倍数体iPSCを作製することも可能です。 969>
哺乳類の性染色体は、男性（XY）と女性（XX）の生殖細胞の発生に特化した役割を担っています（1）。 性染色体異常は、ヒト不妊症の最も一般的な遺伝的原因である(2)。 性染色体トリソミー（SCT）であるクラインフェルター（XXY）とダブルY（XYY）症候群では、それぞれ過剰なX遺伝子とY遺伝子により精子形成が阻害されます（2）。 XYYの男性は、余分な性染色体が自然に失われる（モザイク化）ため、一般的に生殖能力があります。 XXY男性では、モザイクはあまり一般的ではありません。 精巣からの精子採取により、若いクラインフェルター男性からの生殖が可能な場合もあるが、高齢の患者では成功率は低い(3, 4)。 SCT不妊を研究するために、我々は、蛍光レポーター遺伝子Blimp1-mVenus（BV）およびStella-ECFP（SC）（5）を導入した成体XXYおよびXYYマウスを作成し、多能性幹細胞から始原生殖細胞様細胞（PGCLC）（6）へ分化する過程を観察した。 XXY雄は、野生型雌とXY含有精子を産生する性染色体変異型雄を交配して作製した（fig. S1）。 XYYマウスの作製には、両親からY染色体を受け継ぐことが必要である。 そこで、父方遺伝の野生型Y染色体と、母方遺伝のYd1染色体のうち、精巣決定因子Sryを発現しないものを用いた（図S1）(7)。 先に示したように（8、9）、両モデルにおける精子形成の表現型はSCT男性におけるものを再現しており、XXYマウスでは前駆細胞期で、XYYマウスでは分生子期で停止した（fig. S2）。
次に、SCTと対照のXYおよびXXマウスから線維芽細胞を樹立した（図1A）。 X遺伝子SlxおよびY遺伝子SlyのDNA-蛍光in situハイブリダイゼーション（DNA-FISH）により、継代4（P4）SCTおよびコントロール線維芽細胞が元の性染色体構成を保持していることを確認した（図1Bおよび図S3A）。 線維芽細胞は、ドキシサイクリン（Dox）誘発性の方法で人工多能性幹細胞（iPSC）（10）へ再プログラムされた。 図1 SCT線維芽細胞のiPSC再プログラムによる染色体喪失
（A）XXY、XYY、XY、およびXX iPSCを生成するための実験スキーム。 2i、GSK3ßおよびMek1/2の阻害剤；LIF、白血病抑制因子。 (B〜D）XXYおよびXYYマウスの（B）線維芽細胞およびP2iPSCのSlx（緑）およびSly（マゼンタ）DNA-FISH（n = 50細胞）。 スケールバー、5μm。 (E) P2 iPSCの性染色体補体。 各バーはiPSC株と各補体を示す細胞の割合を示す（n = 50 cells per line）。 括弧内の数字は調べたiPSCラインの数を示す。 969>
SCT由来のiPSC株は高い割合で性染色体喪失を示した。 XXYマウスからは、XY、XX、XOのiPSCが観察された（図1、C、E）。 XYマウスからは、XY、XX、XOのiPS細胞が観察された（図1、C、E）。X染色体とY染色体の喪失率は同程度であった（P = 0.062, Mann-Whitney 検定）。 XYYマウスからは、XYとXOのiPSCが観察された（図1、D、E）。 XYY雄のY染色体喪失は、XXY雄のX染色体とY染色体を合わせたものと同様の頻度で起こった（P = 0.089, Mann-Whitney 検定）。 次に、SCT由来とXYおよびXX由来のeuploid iPSCとの間で性染色体喪失の発生率を比較したところ、XYおよびXX由来のiPSCでは、性染色体喪失の発生は見られなかった。 性染色体喪失を定義するために使用したカットオフに関係なく、SCT由来のiPSCでは、euploid由来よりも性染色体喪失が一般的であった（図1E）（図S12D）
Sex chromosome loss may occur during reprogramming of SCT cells or propagation to P2, perhaps confering a proliferative advantage to resulting euploid cells. 実際，性染色体の不安定性は多能性幹細胞で観察されている（11，12）。 後者の仮説を検証するために、私たちは、高親和性（>90%）の相補体を持つiPS細胞において、P2とP6の間の性染色体の安定性を分析した（図S4A）。 その結果、XXおよびXXYのiPSCでは性染色体の消失が観察されたが（それぞれP < 0.01 および 0.05; Wilcoxon signed-rank test）、XYおよびXYYのiPSCでは見られなかった（それぞれP = 0.21 および 0.66; Wilcoxon signed-lank test）。 しかし、親の相補性が15%以上減少したiPSC株はなかった（図S4B）。 さらに、P2-P6間の性染色体喪失はトリソミーに偏らないことがわかった（図S4B）。 SCT由来の2倍体XY iPSCも、XXYまたはXYY iPSCに対して増殖の優位性を示さなかった（図S5）。 SCT線維芽細胞も核型的に安定していたことから（図1Bおよび図S3A）、染色体喪失はiPSC再プログラム中に誘発されると考えられ、したがって多能性幹細胞における性染色体不安定性とは異なる（11, 12）。 我々はこの現象をトリソミーに基づく染色体喪失（TCL）と呼ぶ。
次に我々はSCT線維芽細胞から得られた真性XY iPSCが機能的な精子を形成するかどうかを決定した。 Doxフリー培地に適応した高度に真性（細胞の80%以上がXY）のP6 iPSCを選択した（図S6）。 XYY実験では、Yd1染色体ではなく、野生型Yを保持するXY iPSC株のみをPGCLC実験に使用した（図S7）。 核型分析により、SCT由来の全てのXY iPSC株と対照のXY iPSC株は、真性であることが確認された（図S8）。 これらのiPSC株は、エピブラスト様状態を経て分化させ（6）、BVおよびSCに陽性のPGCLC凝集体を作製した（図2A）。 BV陽性PGCLC（表S1）を蛍光活性化細胞選別（FACS）により単離し（図2B）、生殖細胞欠損W/Wv（Kit変異体）精巣に移植した（13）＜969＞＜3877＞移植後9〜10週目にレシピエントの精子形成が評価された。 iPSC由来PGCLC移植後に観察されるテラトーマは（6）、XXY由来移植株の29％、XYY由来移植株の50％に存在した（図S9）。 精子形成コロニーの存在（図2C）および組織学（図2D）によって明らかにされる精子形成の再構成は、使用したすべてのXXY-およびXYY-由来のiPSC株で観察された（表1）。 したがって、SCT由来のXY iPSCはin vitroで生殖細胞に分化し、移植後に精子形成を完了することができる。
- View popup
- View inline
私たちは移植で作った精子で生殖を支えられるかどうかを問うた。 XXY- および XYY- 由来の 2 つの XY iPSC 株 (図 2E および図 S10A) の精子を用いた細胞質内精子注入 (ICSI) により、試験管内で 2 細胞胚に発達する接合体が生成された (効率 76.5%)。7から87.3％）（図2F、図S10B、および表S2）、レシピエントに移植した場合は肉眼的に正常な子孫（効率46.9から59.4％）（図2G、図S10C、および表S2）が生成されました。 ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子型判定で、子孫は移植されたPGCLCに由来することが確認された（図S10D）。 XXYおよびXYY由来のiPSC株からの仔は、対照のXY iPSCに由来する仔と同等の成長を示した（図S10E）。 注目すべきは、XXY-およびXYY-由来の仔が、2倍体（XYまたはXX）の相補体を有していたことである（図S11）。 XXY-およびXYY由来のiPSCラインからそれぞれ3匹の成熟した雄と3匹の雌を互いに交配させたところ、全員が受胎可能であった（図2Hおよび図S10F）。 このように、SCT由来のXY iPSCからの精子は、染色体的に正常で、健康で、受胎可能な子孫を生じさせるのである。 常染色体の完全なトリソミーを持つマウスモデルは存在しないため（14）、ヒト21番染色体（hChr.21）をアクセサリーとして持つダウン症モデルである雄Tc1トランスクロモソミーマウスで実験を繰り返した（15）。 Tc1マウスはhChr.21を挿入したネオマイシン耐性カセットを持ち、その選択によってhChr.21モザイクを減少させることができる(15)。 そこで、まず成体Tc1線維芽細胞を、ネオマイシン類似物質G418を用いてhChr.21の存在について濃縮した（図3A）。 DNA-FISHの結果、Tc1線維芽細胞の大部分（≧96％）がhChr.21を保持していた（図3Bおよび図S3B）。 これらのTc1線維芽細胞をG418選択せずに再プログラムし、得られたiPSCをP2において解析した。 生成された16個のiPSCラインのうち10個（62.5％）は、細胞の10％以上でhChr.21の消失を示した（図3、CおよびD、ならびに図S12D）。 一方、G418除去後、iPS細胞の初期化に用いた期間と同じ期間（18日間）培養したTc1線維芽細胞や、P2時に高親和性（>90% hChr.21陽性）相補体を有するP6 iPSCラインではhChr21が保持されていた（図S12、AおよびB）。 Tc1細胞におけるhChr.21の消失は、G418除去よりもむしろ初期化によって促進され、したがってTCLは付属染色体にも影響を与えると結論した
(A) Tc1 iPSCを作成する実験計画。 (BおよびC) Tc1マウス由来の(B)線維芽細胞および(C)P2 iPSCのSlx (緑) およびhChr.21 (マゼンタ) DNA-FISH (n = 50細胞)。 スケールバー、5μm。 (D) P2 iPSCの染色体補填。 各バーはiPSCラインと各補完物を示す細胞の割合を示す（ラインあたりn = 50細胞）。 括弧内の数字は、調べたiPSCラインの数を示す。 969>
次に、ヒトの細胞でTCLが起こるかどうかを検討した。 ヒトのトリソーム細胞培養中に染色体喪失の事例が観察されているが（16、17）、その有病率とリプログラミングとの関係は系統的に分析されていない。 我々は、最小限のモザイクを示すヒトクラインフェルター症候群、ダウン症候群、真性XYおよびXX線維芽細胞株を選択し（図S13、AおよびD）、それらを再プログラムし、得られたiPSC株の染色体構成を決定しました。 クラインフェルター症候群の線維芽細胞からはXYおよびXXのiPSCが、ダウン症候群の線維芽細胞からは8倍体のiPSCが観察された（図S13、B、C、F、およびG）。 染色体喪失は、ディスオーム細胞よりもトリソーム細胞でより一般的であり、ヒトの初期化においてもTCLが発生することが示された。 しかし、高度に真性化したiPSCラインの頻度は、トリソミー由来のマウスiPSCで観察されたものよりも低かった（図S13、FからH）
我々は、TCLがSCTおよび常染色体トリソーマウスおよび患者から真性化iPSCを産生することを明らかにした（図S12E）。 マウスでは、得られた「修正」iPSCは機能的な精子を形成することができ、不妊のSCT個体から染色体的にeuploidの子孫を生産することが可能である。 TCLは、染色体異常に対する既存のiPSC療法を補完するものです（17-21）。 TCLを引き起こすメカニズムは不明である。 再プログラミングに伴う細胞ストレスがトリソーム細胞を選択し、2倍体細胞の出現を可能にしているのかもしれない。 我々は、マウスよりもヒトの方がTCLの発生頻度が低いことを確認した（図S12DおよびS13H）。 たとえ稀であっても、TCLは、代替的アプローチが成功しない不妊症SCT患者に治療法を提供する可能性があります。 しかし、試験管内で作られたヒト生殖細胞の臨床利用は、倫理的、法的にも慎重に検討されるべきで す（22-24）。 さらに、生殖細胞移植によって生じる奇形腫形成のリスクを回避するために、試験管内での完全な精子形成が開発されなければなりません。
TCL では、男性から女性の iPSC を製造することもできるため、性的二型の遺伝的解剖の可能性があります（25）。 性染色体に関してのみ異なるアイソジェニックiPSCラインを作成することにより、iPSC疾患モデリング中に同定された性差を、XまたはY染色体の影響に帰することができる。 S1 to S13
Tables S1 to S3
References (26-34)
This is an article distributed under the terms of Science Journals Default License.
に感謝の意を表する。