Abstract

この研究の目的は、Exiguobacterium sp. 12/1 (DSM 21148) 株が生産する有機酸が飲料産業から発生するアルカリ性廃水中和への役割を調査することであった。 本菌はpH12.0の培地で増殖し、pH12.0からpH7.5までのアルカリ性工業廃水を中和することが知られている。 FT-IR分光法を用いて培地中に存在する官能基の種類を調べたところ、カルボニル基とヒドロキシル基に相当するピークが存在し、カルボン酸または関連代謝産物の放出が示唆されました。 RP-HPLC を用いて特定のカルボキシル基を同定したところ、培養上清中にギ酸に最も近い保持時間の単一ピークが存在することが判明した。 異なる炭素源で生成された酸の濃度を時間の関数として調べた。 酸は最終的に同じ濃度で存在したが、酸の生成速度はショ糖を添加した培地の場合が最も高く、次いでフルクトース、グルコースであった。 本菌の代謝産物に関する知見は，飲料業界からのアルカリ性廃水の大規模なバイオレメディエーションに対する本菌の可能性を実現するための第一歩と考えられる

1. はじめに

アルカリ性微生物（pH9以上を生育至適温度とする微生物）は、工業的応用において大きなインパクトを与えている。 生物洗浄剤には、アルカリ性微生物から生産されたアルカリ性セルラーゼやアルカリ性プロテアーゼなどの酵素が含まれています。 例えば、アルカリ性シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼによるシクロデキストリン、アルカリ性活性マルトヘキサオース生成α-アミラーゼは、食品、化学、医薬産業で利用されています。 アルカリ処理された木材パルプは、アルカリ性細菌が生産するキシラナーゼによって生物学的に漂白されることが報告されている。 藤原らは、アルカリプロテアーゼでX線フィルムのゼラチン質を分解し、銀を回収することを報告している。 このように、アルカリ性細菌は、細胞外酵素やアルカリ性・アルカリ安定性などの生化学的性質から、多くの関心を集めている。 また、その生体エネルギー学的な研究も進んでいるが、細胞内酵素や代謝物などの生理的な研究についてはほとんど知られていない。 中間代謝過程の特徴は、菌の特徴、酵素組成、細胞の代謝段階、代謝工学の可能性などに役立つため、重要である。 アルカリ性細菌が炭水化物を含む培地のpHを強く変動させる能力を利用して、Exiguobacterium sp.12/1株を用いて飲料産業から排出される高アルカリ性廃水の中和を行ったことがある。 Exiguobacterium属はBacillales目に属し、Bacillus属のメンバーも含んでいる。 Exiguobacterium sp.12/1は、pH10で最適に増殖する通性アルカリ性細菌で、アルカリ性廃水をpH12.0からpH7.5まで中和する能力がある。 この細菌は、高アルカリ性の外部培地を中和するために、何らかの酸性の代謝産物を放出すると推測される。 しかし、細胞外培地に放出される代謝産物の種類を明らかにすることは重要である。 ここでは、アルカリ中和のメカニズムとして考えられる有機酸の産生について研究しています。

清涼飲料水産業排水の主な炭素源はスクロース（グルコースとフルクトースを含む二糖類）であり、生物化学的酸素要求量（BOD）の主な要因にもなっている。 清涼飲料水産業廃水の平均BODは600～4500 mg/Lで、これは673～5052 ppmのスクロースに相当する。 単糖で生育する多数の細菌の代謝産物に関する文献調査によると、細菌はこれらの単糖を利用して有機酸を生成している可能性が示唆されている。 このことは、他のアルカリ性Bacillus属の細胞外代謝産物の分析によってさらに裏付けられる 。 これらの研究では、スクロースを炭素源として生産される主な有機酸は酢酸であることが判明した。 蟻酸は嫌気性条件下における好中性細菌の一般的な代謝産物であるが、B. circulans var. alkalophilusは好気性培養においても最大2g/Lの蟻酸を生産している。 その他の揮発性酸であるプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸はBacillus alcalophilus ssp. halodurans、B. alcalophilus、Bacillus sp.17-1 株に典型的に見られる。 イソ酪酸とイソ吉草酸は、いくつかの好中球性細菌の培地中に報告されている。 しかし、これらの酸は、プロピオン酸や酪酸と同様に、Clostridium sp.の研究に基づいて、アミノ酸に由来するものと考えられている。 乳酸やピルビン酸は好中性細菌がごく普通に生産するが、バチルスによるコハク酸の生産は稀である。 エタノールは多くの好中性菌のグルコース培養による典型的な生成物であるが、アルカリ性菌では検出されていない。 このように、アルカリ性の増殖条件は中性代謝産物の生産に影響を与える可能性がある。 本研究では、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて、異なる種類の炭素源を含む高pH培地の中和中にExiguobacterium 12/1株が生産する酸の種類と濃度を検討した。 Strain and Culture Conditions

Exiguobacterium sp.12/1の培養液はDSMZから入手し（DSM 21148）、グリセロールストックとして保存していた。 ペプトン、1；酵母エキス、0.5；グルコース、1；K2HPO4、0.1；Na2CO3、1；pH10（最後の3成分は、別々に滅菌した溶液からオートクレーブした培地に添加）を含む（全ての濃度はg/L）アルカリ基礎培地（ABM）を37℃で菌株12/1のルーチン培養に使用した。 IRおよびRP-HPLC分析のために、この細菌は、（すべての濃度をmMで）含む最小塩培地（MSM）中で37℃、200 rpmで培養された。 K2HPO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA二ナトリウム塩, 0.3; ZnSO4-7H2O, 0.01; MnSO4, 0.02; CuSO4-5H2O, 0.004; FeSO4-7H2O, 0.1; NaMoO4-2H2O、0.004; (NH4)2SO4, 5および1% (w/v) の炭水化物：グルコース，フルクトース，スクロースのいずれか（すべての成分は，別途オートクレーブで濃縮したストック溶液から添加した）。 培地の最終pHは1N NaOHで10.5に調整した

2.2. 増殖および培養pHの解析

ABM上の対数期培養液1mLを用い、前培養液（50mL）（1％糖含有MSM）に接種した。 実際の試験培養（500 mL 三角フラスコに250 mLのMSM）は、対数期中期（O.D.〜1.2）の前培養物全体を植菌した。 各培養セットは3本のフラスコから構成されている。 650 nmの吸光度を細菌の増殖の指標とした。 pHは無細胞培養試料を4000×g、20分間遠心分離後、室温で測定した

2.3. FT-IR分析

培養物を60時間培養後に採取し、4000×g、20分間遠心分離を行った。 IR分析には、培養上清を凍結乾燥し、粉砕して粉末状にしたものを使用した。 その後、粉末状の上清と臭化カリウムを混合し、混合物をプレスして錠剤とした。 最後に、FT/IR-4200 spectrometer (JASCO, Tokyo, Japan)を用いて錠剤を分析した。 RP-HPLC分析

異なる時点で培養物を採取し、4000×gで20分間遠心分離した。 HPLC分析では、培養上清を0.22μmのフィルターでろ過し、ろ過した試料10μLをHPLCカラムに注入した。

分析用標準グレードのギ酸、酢酸、コハク酸、プロピオン酸、乳酸、イソ酪酸はSigmaから入手した。 標準溶液（100 mg/mLまたは100 μL/mL）を調製し、4℃で保存し、さらに使用した。 作業用標準液（10 mg/mL または 10 μL/mL）は毎日調製した。 各化合物および試料の緩衝液およびストック液の調製には、Milli-Q water（Millipore社製）を使用した。 ストック溶液、サンプル、バッファーは、セルロースメンブレンフィルターWhatman（0.45μm, Whatman, Clifton, NJ, USA）で濾過した。 溶媒は使用前に真空下で脱気した。

有機酸分析は、Tormo and Izco .の方法に従って行った。 分析は、1525 binary HPLC pump, 717 plus autosampler, and 2487 two channel UV detector set at 210 nm からなる Breeze System (Waters, Mildford, MA, USA) で行い、Breeze ソフトウェアを使用して操作した。 分離はAtlantis dC18 カラム（Waters）250 × 4.6 × 5 μmで実施した。 リン酸でpH2.20に調整した20 mMのNaH2PO4を毎日調製し、0.2 μmの親水性膜（Millipore）で濾過した。 溶媒プログラムは、リン酸でpH2.20に調整した20 mMリン酸バッファー（溶媒A）およびアセトニトリル（溶媒B）中に1%のアセトニトリルを含む2つのリザーバーを利用し、流速は室温で1.5 mL/minに設定されました。 グラジエントプログラムは溶媒Aを100%として開始し、7分後に溶媒Bを直線的に増加させ、5分で7%に到達させた。 12分から19分までは溶媒Aを93%、溶媒Bを7%に保ち、その後、流速を開始時の条件に変更して15分間カラムを平衡化してから次の試料を再び10μL注入しました。 結果

3.1. 定義培地での中和の分析

細菌が生産する有機酸の分析には、定義培地であり、飲料産業廃水と炭素源が似ていることから、最小塩培地を選択した。 菌は、異なる炭素源であるグルコース、フルクトース、スクロースを添加した最小塩培地で生育させた。 図1は、生育プロファイルと培地のpH特性を経時的に示したものである。 フルクトースとスクロースは、グルコースと比較して、培地の中和が非常に速かった。 また、グルコースで得られた最終的なpHは、スクロースやフルクトースで補った培地の場合よりも若干高くなった。 このことは、3つの炭素源で増殖した細菌の増殖プロファイルにも反映されている。 細菌はスクロースでより速く成長し、フルクトースとグルコースがそれに続いた。

(a)

(b)

(a)
(b)

図1

pH（a）およびO．D. (b)のMSM上での経時変化。 数値は3回測定の平均値、エラーバーは標準偏差を表す

3.2. 培養上清に存在する官能基の同定

アルカリ廃液を中和するために菌が生産する代謝物の機能的な広義の官能基を同定するために、凍結乾燥した培養上清をFT-IRスペクトルに供した。 スペクトルにはカルボニル基（1644.98cm-1）と水酸基（3436.74cm-1）に対応する2つのピークが存在した（表1）。 文献調査によると、本菌は代謝産物として有機酸を生成し、アルカリ性廃水を中和している可能性が高い。

3.3. 本菌の特異的代謝産物の同定

本菌が生産する有機酸を同定するために、文献調査により選定した既知の有機酸標準物質を用いて逆相HPLCを行った。 培地中の他の有機酸による干渉で生じる保持時間の違いを確認するため、標準物質を単独(図2(a))と混合(図2(b))の両方で測定した。 両者の標準有機酸のRTは、プロピオン酸を除いて保持時間の差が0.09単位を超えず、同様であることがわかった（Table 2）。 培養上清を同じ方法で分析したところ、ギ酸と同様の保持時間を持つ単一のピークから構成されていることがわかった。 さらに、上清に標準ギ酸を添加したところ、そのピークは上清中の生成物のピークと重なった（図2（d））。

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

3.4. 細菌の代謝産物の定量分析

培養上清の定量分析では、異なる標準濃度のギ酸を実行し、各濃度に対応するピーク面積を算出した。 ピーク面積を濃度に対してプロットし、標準曲線を得た(図3)。 この標準曲線を用いて、異なる炭素源を添加した最小塩培地での時間経過に伴う酸の生成量を算出した。 また、本菌の培養上清を時間依存的に分析し、再度逆相HPLC分析に供した。 その結果、菌体培養上清中の主要生成物のピークが時間と共に増加することがわかった。 また、その保持時間はギ酸の保持時間とほぼ同じである。 異なる炭素源で生成されたギ酸の時間の関数としての研究を図4に示す。 ショ糖を添加したMSMの場合に最も多くの酸が生成され、次いでフルクトース、グルコースの順であった。

図3