材料と方法

サンプル収集

18歳以上の参加者は、BCバンクーバーにあるUniversity of British Columbiaの掲示板に掲載されるメール通知および広告で研究参加を呼びかけられました。 参加者は、ドライロック式頬粘膜スワブ（Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA）とスポンジチップ式頬粘膜スワブ（Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON）を用い、自己指示によるサンプル提供を求められた。これらのサンプル提供順序はコンピュータで無作為に決定された。 サンプル採取時にはリサーチアシスタントが同席し、サンプル採取の指示に関する参加者の質問に答えた。 すべてのサンプルは室温で保存された。

DNA extraction

DNA は Ambion MagMAX bead-based DNA extraction kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) を用いて、製造者の指示に従って抽出された。 DNAはサンプル採取の3日後に抽出され、60 µlで溶出した。 DNA の量と質は、Qubit 2.0 fluorescence assay (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) を用いて評価した。 サンプルの純度はNanoVue分光光度計を用いて光学密度A260/280 (ODA260/280) 値で決定した。

Genotyping

Genotypingは QuantStudio 12K Flex quantitative polymerase chain reaction (qPCR) instrument (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) でメーカー (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) が検証したアッセイに基づいて実施された。 アッセイの内容は、OpenArrayプラットフォームの薬物反応に影響を与える28のSNPs（Additional file 2参照）とCYP2D6 CNV TaqManアッセイ（Assay ID：Hs_00010001_cn）であった。 アッセイを検証するために、National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Coriell Institute for Medical ResearchのHuman Genetic Cell Repositoryからの44のDNAコントロールがジェノタイピングされた。 コールと予想される遺伝子型との一致が確認された。 さらに、コントロールDNAのサンガーシークエンスにより、結果が検証された。 各実行について、参加者サンプルはOpenArrayで二重に、CNVアッセイでは陽性対照および鋳型なし対照（NTC）として使用されたCoriell DNAサンプルとともに四重に実行された

統計解析

OpenArrayでのSNP遺伝子型判定率を決定するのにTaqMan Genotyper software v1.3.1 (Applied Biosystems) が使用された。 Genotype call rateは、各OpenArrayアッセイについて、正常に割り当てられた遺伝子型の総数を遺伝子型の割り当てを試みた総数で割って算出されました。

CNVについては、CYP2D6コピー数コールとCNV信頼度スコアを割り当てるためにTaqMan Assay CopyCaller v2.1 software (Applied Biosystems, Foster City, CA)が使用されました。 DNAサンプルには野生型の2倍体コピー数を割り当て、コピー数の変動（欠失または重複イベント）はそれぞれ2NおよびCNVグループに分類された。 SNPとCNVのジェノタイピング結果には、それぞれ95%のジェノタイピングコール率と95%の信頼度スコアが設定された。 不等分散を仮定した2標本Studentのt-testを計算し、異なるDNAタイプからのペアのDNA収量、純度、コール率の有意差を判定した。 また、同じ参加者のDNAサンプルタイプ（スポンジチップとドライブロック）から作成されたジェノタイピングアサインメントを比較し、コンコーダンス（一致度）を算出した＜5193＞＜4353＞結果＜9898＞＜6781＞31人の参加者を募集し、スポンジチップとドライブロックのスワブを採取した。 参加者は、どちらのタイプのスワブでも、採取のためのセルフガイドの指示がわかりやすく、従いやすいと感じた。 参加者からは、綿棒をこするのに必要な圧力や、綿棒を口の中に入れる際の正しい位置について質問が出されました。

乾式スワブとスポンジ付きスワブでは、DNA採取量に有意差があった（0.26 ± 0.34 µg 対 1.91 ± 1.44 µg p = 4.4 × 10-7; 表1）。 すべての採取方法の平均DNA純度は、乾燥スワブとスポンジ付きスワブで、それぞれ純DNA（平均（SD）1.72（0.78）および1.85（0.39））の許容範囲内であった。

スポンジチップで採取したスワブでDNA濃度が低い（< 5 ng/μl）サンプルが3つあった。 これら3つのサンプルは、OpenArrayでのジェノタイピングコール率が100%、CNV信頼度スコアが100%であった（図1）。 逆に、DNA濃度が79 ng/µlであったサンプルのうち1つは、OpenArrayのコール率が最も低かった（18％）。 ドライフロックスワブでOpenArrayのコール率が最も高かった（> 95%）のは、濃度が1.2～8.9 ng/µlの7サンプルであった（Fig.1a）。 最も高いCNV信頼度（> 95%）は、濃度が1.0～24.4 ng/µlのサンプルで観測されました（図1b）。 1

OpenArrayの全てのアッセイについて。 スポンジ綿棒から採取したDNAサンプルは、ドライフロックスワブ（54%）と比較して、全体的に高いジェノタイピングコール率（97%）となりました（図）。 2). 抽出したDNAを0.5倍に希釈するステップを追加した場合、スポンジチップの綿棒は一貫してジェノタイピングコール率 > 95%を示した。 OpenArrayのサンプルコール率には個人差があり、29名（93.5%）の参加者がスポンジチップDNAからのサンプルコール率> 95%、4名（12.9%）がドライロック綿棒DNAからのサンプルコール率> 95%であった。 また、同一人物から採取したスポンジ付き綿棒とドライロック綿棒の間では、94％の一致が認められた。 2

CYP2D6 for copy number calls was assigned to 2 (6.5%) the sample from sponge-tipped swab, with overall confidence score of 0.99.5.5.

Discussion

この研究の目的は、研究者や企業がジェノタイピングのために高品質のDNAを得る最適な収集方法を特定するのに役立つことである。 本研究では、2種類のスワブについて、DNA収量に有意差はあるものの、DNA品質は高い（ODA260/A280 1.8と定義）ことが新たに明らかになった（p値=4.4-7）。 OpenArrayプラットフォームでは、スポンジチップ綿棒が最も高いジェノタイピングコール率（97％ vs 54％）を示し、CYP2D6 CNV TaqManアッセイの信頼度スコア（0.99 vs 0.91）が最も高くなりました。 > 95%のSNP genotyping call rateは許容できる品質のデータを反映していると考えられ、99%のCNV confidence scoreは高品質と考えられます。

スポンジチップ綿棒から分離した1つのDNAサンプルは95%以下のコールレートを有していました。 ルーチンラボの実践では、コール率の低いサンプルは、患者報告用の不完全な結果のために再採取されるであろう。

CYP2D6 CNVの結果、dry-flocked swabから採取したDNAは、spong-tipped swabと比較してCNVの割り当てが8（25.8%）増加し、2（6.5%）となった。 CNVの割り当て数が多いほど、信頼度スコアが低いという相関が見られた。 30名（97％）の参加者は、スポンジ綿棒について高い遺伝子型判定コールレートを示すサンプルを採取することができたが、4名（13％）の参加者は、両方のタイプの綿棒について高いコールレートのサンプルを採取することができたのみであった。 以上の結果より，スポンジ綿棒は患者にとって受け入れやすく，qPCRによる薬理遺伝学的検査に十分な量の良質なDNAを採取することができた

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