Abstract

精液の高粘性化は精子の運動性を低下させ、男性不妊の原因となる。 本研究は，DNaseが複数の種の精液中に存在すること，好中球が細菌を捕捉するためにクロマチンを放出することを考慮し，外因性DNaseの精子品質改善能力を評価することを目的とした前向き研究である。 この解析では、試験群として高精液粘度（HSV）の精液77検体、対照群として正常精液粘度（NSV）の精液62検体が比較された。 これらの精液サンプルは、（a）DNase Iによる37℃、15分間の処理、（b）密度勾配遠心分離による処理、（c）上記2つの方法の組み合わせによる処理を受ける3群に分けられた。 高粘度精液を15分間処理した後、83％の精液サンプルの精子の運動性が統計的に有意な程度に増加した。 逆に、粘度が正常な精液をDNase処理しても、そのような効果はなかった。 また、上記の処理により、正常精子の割合が有意に増加し、その結果、催奇形性指数が大きく減少した。 DNase I処理後に密度勾配遠心分離を行った精液と、密度勾配処理のみで採取した精液とを比較したところ、前者の方がより顕著な結果が得られた。 それぞれの製剤を収率（最初の総精子数に対する処理後の進行性精子数の割合）で評価したところ、密度勾配処理単独では18.5％に対し、複合処理では29.8％となった（p＝0.0121）。 DNase I処理により精子の運動性と形態が改善され、生殖補助医療プロトコルで高粘性精液の男性に有益である可能性がある。 はじめに

研究では、精液粘度過多（SHV）が射精の12～29%で発生することを記録しています。 SHVは精液の物理的・化学的特性を著しく損なうため、男性不妊の原因となり得る状態である。 SHV は精液の物理的・化学的特性を著しく損なうため、男性不妊症の原因となる可能性があり、精子の運動性低下、体外受精の成績不良、活性酸素の産生増加などと関連している。 さらに、不妊症の男性では、精液の酸化損傷生成物レベルと精液の粘度が有意に相関している。

男性生殖器を介した精子の輸送中の活性酸素の生成を通じて精子の質を損なう抑制経路の存在、実験室の取り扱いおよび保管中の精子損傷の兆候、さらには射精後に「自動的に」活性酸素がさらに生成する兆候、少なくともいくつかの精液過粘度のケースでの兆候が強く示唆されている。 この状態は、病態生理がまだ完全に理解されていないにもかかわらず、ほとんどが男性付属性腺感染症および精索静脈瘤と関連している。 さらに、精液過多の症例では、乏精子症の検体で精液の抗酸化能の低下が検出された。 さらに、過剰に発生した活性酸素は過酸化脂質を引き起こし、膜の形態を破壊する。 精液中の白血球レベルの増加は、SHVと関連している。 さらに、白血球は精液中の活性酸素とレトロウイルスのベクターの主要な供給源であり、その存在は妊娠の確率の低下、子宮内人工授精（IUI）および従来の体外受精の成功率の低下と関連している ………このように、白血球は精液の活性酸素とレトロウイルスのベクターとして知られています。 さらに、SHVは精液の微生物叢の構成と病原性細菌の高い有病率と相関している。

SHV精液の粘度を下げるという設定で、いくつかの治療アプローチが提案されてきた。 過水分補給および前立腺マッサージは有効ではなかった . SHVは機械的な現象ではないので、5mlの注射器による精液の穏やかな吸引と排出はほとんど効果がない。 キモトリプシンを用いたタンパク質分解は、精子タンパク質に若干の変化が生じるものの、高粘性精液の取り扱いを改善する。 このような処置は精子の構造を損傷する可能性があること、またほとんどの場合SHVは白血球精子症と相関していることを考慮し、我々はSHVが好中球細胞外トラップ（NET）に起因し、DNase IによるDNA分解に敏感であると仮定した。我々の知る限り、これはSHVに対処するために、DNase Iを使用したという最初の報告である。 参加者

Locus MedicusのMedical Clinic of Athensの不妊症歴のある患者を対象に、以下の除外基準で3年間にわたり前向き研究を行った：性腺機能低下症、停留睾丸、先天性精管閉塞症。 HSVに感染した77の精液を研究グループとして、NSVに感染していない62の精液を対照グループとして、以下のように層別化した。 HSVの精液32検体とNSVの精液10検体をDNase Iで処理し，さらにHSVの精液26検体とNSVの精液52検体を密度勾配遠心法（DGC法）で処理し，HSVの精液32検体とNSVの精液10検体をDNase Iで処理し，HSVの精液26検体を密度勾配遠心法（DGC法）で処理した． 最後に，19検体のHSVを，DNase Iによる初期処理とDGCを組み合わせた方法で処理した。 すべての参加者は、いかなる関与の前にもインフォームドコンセントフォームに署名した。 精液分析

3〜5日間性的禁欲をした後に自慰で得た精液サンプルを、無菌容器に入れた。 採取後、精液検体は37℃で液化させた後、従来の分析精液分析基準値、上記の複合工程の前と後を行った]。 運動性の評価は、本研究に関与していない、同じ公式訓練を受けた（ESHRE）生物学者によって行われた。 白血球の存在は、WHO 2010ガイドラインに従って、ペルオキシダーゼテスト（Leukoscreen FertiPro; ベルギー）により評価された。 粘性は定量粘度計で評価できるが、精液の粘弾性は、プラスチック製の使い捨てピペットを用いて、重力で精液を落下させ、糸の長さを観察することで推定した。 精液の糸の長さが2cmから4cmの男性を軽度SHV（53.12％）、4cmから6cmの男性を中等度SHV（40.62％）、6cm以上の男性を高度SHV（6.25％）と分類し、高粘性グループ（HV）としたが、粘弾性が2cm以下を正常とした＜9330＞ ＜8299＞ 2.3. 酵素処理

正常精液と高粘度精液を対象に、DNase Iの効果を検討した。 液化後、DNase Iを精液サンプルと一緒に滅菌容器に20U/mlの最終濃度になるように静かに引き込み、絶えず混合し、その後37℃で15分から60分間インキュベートした。 上記の精液サンプルの運動性および形態を、酵素消化の前後で分析し、いかなる処理前のPR（全精子数の（a＋b）％の運動性）精子の％（すなわち、初期％PR）を評価した＜9330＞＜8299＞2.4。 精液の調製

密度勾配遠心分離法（DGC法）は、製造者の推奨に従って行った。 密度勾配は、15mlの円錐形遠心管に入れた80%培地PureSperm®（Nidacon International, Gothenburg, Sweden）の上に1mlの40%培地を重ねることによって調製する。 精液をグラジェントの上に重ね、300gで20分間遠心分離を行った。 遠心分離の程度や力は、試料の質によって変えることができる。例えば、粘度の高い試料ではスピン時間を長くすることができる。 遠心分離後、上清の大部分を静かに除去し、ペレットを新しい清潔なチューブに入れ、5mlのメデュームによく懸濁させて密度勾配メデュームを除去する必要がある。 その後、200gで10分間スピンし、上清を除去し、最終ペレットを生殖補助医療（ART）用の滅菌培地に再懸濁する。 最後に、コンビナトリアル処理では、高粘度の試料を最初にDNase Iで処理し、その後、上記のDGC法で調製した。 洗浄後の総運動精子数（TPMSC）が子宮内人工授精の効果を予測するのに有用であることを考慮し、それぞれの方法の収量も次のように評価した：DGC法またはDNase Iで処理した後、あるいはDNase I処理とDGC法とを併用した後のTPMSCの割合を処理前の総精子数で割ったものである。 さらに、収量（すなわち、% final PR/total spermatozoa before）を、% initial PR/total spermatozoa before any treatmentと比較した。 収量は、高粘度または正常粘度の精液試料で評価された。 ARTにおいて投与される運動精子の数についてコンセンサスはないが、一般に、あらゆる治療後に各精液サンプルの最大数の運動精子を回収することが重要であると受け止められている。 統計分析

データは、GraphPad Prism 6.0を使用して、一元配置分散分析と多重比較クラスカル-ウォリス検定により分析された。 p値0.05未満を統計的に有意とした。

3. 結果

白血球（WBC）濃度を図1に示す。 全群で統計的に有意な差がある（p=0.0238 one-way ANOVA）。 さらに、HV群内の統計的差は0.0018である。

DNaseⅠを使用すると、高粘度の男性（32名）の精子の運動性が向上することがわかった。 図2（a）が示すように、酵素を15分間添加（t＝15）すると、液化直後（t＝0）の（a）運動の割合が2.875％の精子から8.094％の精子に改善し、統計的に有意である（p＝0.049、多重比較検定）。 さらに、同時点間のPR移動量は27.468%から統計的に有意な46.59%に上昇した（p<0.0001, 多重比較検定）。 同時に、（c）画分の運動率は34.687％（t=0）から21.5％（t=15）に減少し（p<0.0001、多重比較検定）、（d）画分の運動率は37.812％（t=0）から31.968％（t=15）（p=0.45多重比較検定）であった。 正常な粘度の精液にDNase Iを使用しても、図2（b）に描かれているように、どのサンプルにおいても、統計的に有意な方法で精子の運動性を増大させることはない。

さらに15分間培養を続けたところ（32人中21人）（合計30分間、t=30）、図3に示すように、一部の精子の運動性が1.761％（t=0）から9.524％（t=30）へと増加した（p=0.046、多重比較検定）。 興味深いことに、PR運動は24％（t=0）から45.047％（t=30）へと劇的に改善された（p<0.0001、多重比較検定）。 c）、（d）画分の精子の運動性は、それぞれ35.714%から22.08%（p=0.001、多重比較検定）、40.238%から32.238%（p=0.039、多重比較検定）に統計的に有意に減少した。 DNase I処理後の精子粘度を再評価したところ、ほとんどの場合、粘度は正常化、あるいは少なくとも改善されていた。

次に、DNase I処理後に密度勾配遠心をした精子の結果と密度勾配処理だけで得られた結果を比較しました。 サンプルの制限から、この2つの方法は同じ被験者から採取したサンプルではなく、精子の粘度が高い異なる被験者の検体で行われた。 また、子宮内人工授精（IUI）においても密度勾配遠心分離処理を行った。 図4に示すように、DNase I処理後の密度勾配遠心分離後の（a）運動の割合は、密度勾配処理のみの場合の6.333％から26.866％（4.242倍）に対して、3.416％から35.083％（10.27倍）に増加（p <0.0001 、多重比較クラスカル-ワリス検定）していた。 b）の動きについては、DNase I処理後に密度勾配遠心分離を行った場合にも、統計的に有意な改善が見られた（精子数28.583%から40.916%（1.43倍の増加）、p=0.0112）。 密度勾配遠心法群では、それぞれの改善率は34.533％から46.466％（1.34倍）に上昇したが、群間の差は統計的に有意ではなかった（ns、多重比較Kruskal-Wallis検定）。 さらに、PR運動は、第1群では32％から76％（2.375倍）に増加したのに対し、第2群では1.776倍（40.866％から72.666％）に改善した（群間非統計的に有意、多重比較Kruskal-Wallis test）。 精子の(c)および(d)画分の運動性は、それぞれ36.083%から10.583%、31.916%から13.583%に減少した。 密度勾配遠心分離処理群のみでは、それぞれ29.40%から14.80%に減少した（群間非統計有意、多重比較クラスカル・ウォリス検定）

各製剤の初期数（収量）に対する洗浄後のTPMSCを評価した（M&M）。 精液粘度がない個体の場合の密度勾配処理収率は27,096%であった（図5、w/o V-d）。 また、粘度の高い個体の場合の同製剤の収率は18.519%であった（図5、HV-d）。 両者のコントロール（図5、w/o V、HV）に対する変化は統計的に有意であり（それぞれp<0.0001、p=0.0377、多重比較クラスカル-ウォリス検定）、DGC処理後に多くのPR精子が失われたことが示された。 高粘度個体の精子をDNase処理した場合（図5、HV-DNase）、収率は42.47％、密度勾配処理（HV-d）とDNase処理（HV-DNase）の比較では、HV群に対してp<0.0001、多重比較 Kruskal-Wallis試験結果となっています。 上記の成果は大きいものの、密度勾配処理に続くDNase処理の組み合わせ（図5、HV-DNase-d）では、29.782％の収率（HV群に対してp=0.0121、多重比較Kruskal-Wallis検定）であった。 さらに、複合製剤（HV-DNase-d）を処理前の高粘度精液中のPR精子の割合（図5、HV）と比較したところ、p＝0.448となり、PR精子のほとんどが回収されていることが確認された。 また、w/oV-d群との比較では、p=0.619の多重比較Kruskal-Wallis検定により、統計的に有意な差は見られなかった。

次に、DNase Iによる15分間のインキュベーション後の精子形態の鑑定では、図6に示すように、正常精子の割合が5.468％から7.25％、p=0.0197に統計的に有意に増加する。 同時に、頭部異常は 81.75% から 74.937% (p=0.0004) に、頸部異常は 22.062% から 19.343% (p=0.0197) に減少しました。 尾部の異常と細胞質液滴も同じパターンを示している。 これらの形態の変化の結果として、奇形精子症指数（TZI）に大きな影響を与えることが観察されるのは妥当なことである。 図6に示すように、それは1.205から1.084に減少した（p<0.0001）

4． 考察

本研究では、精液の高粘性はNETに由来するものと仮定している。 提示されたデータは、NETsの押し出されたDNAの消化が可能であり、精子の運動性改善につながることを示している。 精子の運動性を向上させ、ARTに使用することを目的として、精漿DNAの酵素消化を検討した。 精子液化後にDNase Iを使用することにより、精子の運動性と形態がともに改善された。 最良の結果を得るために、数回のインキュベーションを行ったが、15分後のインキュベーションで最良の結果が得られた。 この研究の目的は、子宮内人工授精の成功率を向上させることである。 さらに、DNase Iを使用することで、高粘度に伴う形態異常が改善された。 また、精子の濃縮度は、分離された急速精子と緩徐精子の最終数によって評価された。

DNaseI処理後の精子形態が統計的に有意に改善したことは、これらの異常が射精後に現れ、高粘性によって維持されていることを示唆しているのかもしれない。 高粘度精液は抗酸化力が低下していることから、この環境下で精子が存在すると、過酸化脂質やDNA損傷が誘発され、最終的には形態異常が生じる可能性がある。 これらの形態異常の少なくともいくつかは、DNase I処理によって可逆的であることが証明された。 この改善は、子宮内人工授精のように多数の直接運動精子を必要とせず、体外受精や顕微授精のように最良の形態が要求される場合に、上記の処理を最適に適用することを示唆している。 図2(b)が示すように、高粘度がない場合には、DNase Iの使用は効果がない。 具体的には、通常の粘性のもとで、精子の運動性に関係なく、酵素消化は、調べたパラメータのいずれにおいても、統計的に有意な差を生じさせなかった。 それどころか、高粘度精液のコホートでは、図2（a）に示すように、酵素の使用により、統計的に有意にPR運動性が改善された。 また、HV群では、重度粘度の精液が少なかったものの、重度・中度粘度による精子運動性・形態回復に差はなかった。 また、図5に示すように、高粘度群（HV-d）と通常粘度群（w/oV-d）のDGC調製後の統計的有意差は0.0179であり、改善が達成可能であることが示唆された。 また、同図において、複合処理（HV-DNase-d）の収量は、PR精子の割合が回復し、処理前の高粘度（HV）男性の対応精子のレベルに達しており、1例目の最終PR割合（29.782％、HV-DNase-d）は初期PR（26,478％、処理前のHV）と統計的差がない、p=0.4480であることがわかる。 この併用法の意義は、DNase処理のみと比較して収量は減少するが（HV-dとHV-DNaseの間でp<0001）、密度勾配処理により回収した（c）、（d）クラスの精子相手から減算し、精製することで立証された。 一方、DGC調製物の収率（HV-d、18.519%）と「処理前のHV」（26.478%）の対応する統計的差異は有意であった（すなわち、p=0.0322）。

さらに、高粘性精液の機械処理に置き換えられる。したがって、高粘性を克服するために一般的には希釈するか皮下針に引き込んで強制的に通過することになる。 しかし、このような処理は活性酸素の産生を増加させるので、これらの方法は効果的であるとは考えにくい。 さらに、高粘性は脱凝縮の欠陥としてクロマチンの完全性と負の相関があり、これはすでに指摘されている。

一般に、DNase Iの気道への適用は、嚢胞性線維症のケースですでにFDAによって医学的に承認されている 。 さらに、DNaseは精液の天然成分であり、その役割はおそらく、炎症に反応して好中球が動員された後に女性の生殖路に形成されるNETの希釈であり、提案された手順はARTにおいて医学的に適用できる可能性がある。 その役割は、その不在が霊長類の人工授精に悪影響を及ぼすという事実によっても強化される。

超粘性は、正確なメカニズムは明らかではないが、炎症または精液腺の機能不全のいずれかによって引き起こされると思われる。 私たちの研究室が以前に示したように、生殖器のウイルス感染に関連している可能性もある。 精液の粘度を下げる目的でいくつかの治療プロトコールが適用されてきたが、その結果が有望視されることはほとんどなかった . 過度の水分補給や前立腺マッサージなどの方法は、期待された結果をもたらしていない。 α-キモトリプシンなどのタンパク質分解酵素の使用は、期待できる結果をもたらしたが、その使用は採用されていない。

別の研究では、DNase Iが粘度を下げるために使用されたが、この点では最終結果はうまくいかなかった。 著者らは精子の質的パラメータ、すなわち運動性を調査していない。 さらに、インキュベーション時間は私たちが提案したもの（15分）よりもはるかに長く（1時間）、粘度への中立的な影響は、おそらく精液血漿と酵素のインキュベーションが長かったことに起因しているかもしれません。 そのため、抗生物質や抗酸化物質が使用されるようになりましたが、これらの治療法は、主な要因が炎症である場合にのみ、この状態を治療することができました。

炎症刺激にさらされると、精液中の主要な白血球集団である好中球は、食作用による細菌の不活性化、およびその後のタンパク質分解酵素と活性酸素への暴露による死滅を通じて、保護的役割を発揮する。 好中球が病原体を中和する第二の作用様式は、好中球細胞外トラップ（NETs）の産生である。 NETは、主にクロマチンからなる3次元の繊維状ネットワークであり、微生物を捕捉し固定化することができる。 NETは、DNaseには感受性があるが、プロテアーゼには分解されないことが示されている . NETsの形成はDNAに基づくものであり、精液中のDNaseは押し出されたDNAを消化し、絡まった精子を解放することが示されていることから、外因性DNaseの使用は、主に細胞外に露出した好中球DNAの存在に起因する精液過粘着症の場合、貴重な治療法となると仮定した

病態生理面からは、過粘着症を炎症に帰する概念はほとんど確立されている。 炎症反応には、微生物を捕捉するための好中球からのNET形成が含まれる。 精子はNETから解放されるために多くのエネルギーを消費している可能性が高く、その酸化やアポトーシスの状態を調べることは非常に重要である。

本研究では、精子をNETから解放し、精子の品質パラメータ、すなわち運動性や形態を回復させることを目的として、NETの主要成分である精漿の細胞外DNAをDNase Iで溶解させることを試みた。 また、図1が示すように、WBCの濃度と粘度のグレードには統計的に有意な差があることがわかる。 提案した治療法は、射精後の段階に限定したものであり、臨床的なものではありません。 さらに、精子の粘度上昇は精液中にDNAが存在する結果であるという当初の仮説が検証されたが、この仮説の確認にはさらなる研究が必要である。 炎症部位に動員された好中球がNETを形成することを考慮すると、精液中のDNAは好中球に由来するという仮説が立てられた。 この仮説を支持する直接的な証拠を提示することはできなかったが、我々の知識によれば、DNAの主な供給源は炎症下で押し出される好中球のクロマチンであると考えられる

5. 結論

我々の研究結果は、DNase I治療が精子の運動性と形態に統計的に有意な改善をもたらすという結論を支持するものである。 それは、高粘性精液の場合のみ、ARTのための基本的な精子パラメータ、すなわち運動性と形態を改善する。 さらに、我々の発見は、SHVの主な原因がNETの形成であることを示唆し、したがって、このアプローチの治療の可能性と有用性を提案する。

Data Availability

この研究の結果を支持するために使用したデータは、リクエストに応じて対応する著者から入手可能です。

Ethical Approval

本研究で行われ、ヒトが参加するすべての手順は、アテネ国立カポディストリア大学医学部生命倫理・非論理委員会の倫理基準に従い、2014年1月に承認されました（文献番号：1130）。

同意

すべての患者は、本研究に参加する前にインフォームドコンセントを行った。

利益相反

すべての著者は、競合する経済的利益を宣言しない。

著者の貢献

Angelos D. GritzapisとVassilis Tsilivakosは研究を発案した。 Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, and Vassilis Tsilivakosはデータの取得を行い、その設計に参加し、原稿を作成した。 Effrosyni Nosiはイムノアッセイを実施し、Angelos D. Gritzapisは統計解析を実施した。 Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti, およびVassilis Tsilivakosがデータの解析と解釈で参加した。

Acknowledgement

このプロジェクトはLocus Medicus S.A. Clinical Diagnostic Laboratoryから資金提供を受けています。