細胞培養試薬

ヒトAkt1 ORFはGE DharmaconよりpENTR221 vectorとしてグリセロールストックを得た（ヒトAkt1 ORF Clone ID 100067600）. SHタグを含む改変された目的地ベクター（pcDNA/FRT/TO）は、Matthias Gstaiger博士（Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zurich, Switzerland）から寛大に贈られたものである。 Flp-In TREx HEK293 cells (#R780-07), LR Clonase II enzyme mix (#11791-100), pOG44 vector (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) and Dynabeads Protein A (#100.02D) is getting from Invitrogen.また，Dynamic ProteinはInvitrogenから入手した． Xtremegene 9 (#06365787001) はRoche社から入手した。 DMEM (#12430-054) および RPMI 1640 (#22400-089) は GIBCO 社から入手した。 トリプシン（#CC5027.010L）は、Genetics社から購入した。 Normal FBS (#SH30070.03) およびTet Screened FBS (#SH30070.03T) はHyclone社から入手した。 Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazole (#M1404-10MG), Propidium Iodide (#P4170-250 mg) and Lys C protease (#P3428) はSigma社から入手した. SILAC Labelsは、Cambridge Isotope Laboratories, Inc.から調達した。 Protease inhibitor cocktail (100X) (#78429) および Pierce anti-HA agarose beads (#26182) は Thermo Scientific 社から入手した。 MagStrep ‘Type 2HC’ beads (#2-1612-002) は IBA BioTagnology から入手した。 Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Indiaは、HAペプチドを合成した。 Nitrocellulose membrane (#RPN303E) はGE Healthcareから購入した。 トリプシンプロテアーゼ（#4370282）は、AB Sciex社から購入した。 siRNA、Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) はDharmacon社から入手した。 RNase A (#19101) はQiagen社から入手した。

Antibodies for Western Blot

本研究で用いた抗体は、抗HA（#SC-7392；マウスモノクローナル、希釈1：3000）；抗AKT1（#SC-5298；マウスモノクローナル、希釈1：3000）である。1000）および抗GAPDH（＃SC-25778；ウサギポリクローナル、希釈1：1000）；抗CDC2（＃77055；ウサギポリクローナル、希釈1：1000）；抗CCNB1（＃4138；ウサギポリクローナル、希釈1：1000）をサンタクルスから得た。1000）、Cell Signalling Technology社からの抗BUB3（＃ab133699；ウサギモノクローナル、希釈1：10000）、抗API5（＃ab56392；マウスモノクローナル、希釈1：1000）および抗SH3PX1（＃EPR14399；ウサギモノクローナル、希釈1：1。Abcamから2000）；二次抗体はLicor Biosciences-Odyssey goat anti-mouse (#926-32210, dilution 1:15000) and Odyssey goat anti-rabbit (#926-32211, dilution 1:15000) から入手した。

安定細胞株の作製

本研究では、ゲートウェイ互換のAkt1エントリーベクター（pENTR221）を用い、適切な目的ベクター（pcDNA/FRT/TO）の存在下でLR組み換え反応により発現構築物を作製した。 このベクターは、ストレプトアビジン結合ペプチド（Strep）とヘマグルチニン（HA）エピトープタグを含むStrep-HA（SH）タグを含むように改変された。 このSHタグは、最終的に複雑な細胞溶解物からAkt1とその相互作用パートナーを選択的に引き出すために使用された。 誘導性Akt1発現細胞株を作製するために、発現構築物をpOG44リコンビナーゼと共導入し、Tetリプレッサーを安定的に発現するFlp-In TREx HEK293細胞に導入した。 トランスフェクションはXtremegene 9 transfection reagentによって促進された。 Akt1コンストラクトを発現する細胞は、ハイグロマイシンB（75μg/ml）含有RPMI培地（10％TetスクリーンFBS添加）で15〜20日間にわたって選択した。

最適なAkt1発現に必要なTet濃度は、Tet濃度範囲（0.1μg/mlから5μg/ml）でAkt1を発現させることにより決定し、Akt1のタンパク質発現レベルは抗Akt1および抗HA抗体を用いてTet存在時と非存在時にモニタリングされた。 Tetを24時間おきに培養液に添加し、Aktの発現を安定化させた。

PDT 実験

HEK293細胞のPDTは、Tetを最初に投与してから72時間、正常細胞とAkt1過剰発現細胞でモニターされた。 各観察ポイントにおいて、正常およびAkt1過剰発現HEK293細胞104個を96ウェルプレートに3連で播種し、10%血清を含む100μl DMEM培地を使用した。 播種から24時間後にTetを培地に添加し、さらに24時間培養した後、時間0として細胞を回収した。その後、24時間ごとに72時間まで並行して培養した細胞を回収した。 PDTは、各時点の細胞をトリパンブルー染色法でカウントすることにより決定した。

SILAC labelling to differentiate cell cycle phase specific Akt1 interactome

Akt1-overexpressing HEK293 cells were expanded and cultivured in SILAC media containing “light” (K0R0), “medium” (K6R6) or “heavy” (K8R10) isotopes of lysine (K) and arginine (R) for least 5 cell doublings for allowing complete label incorporation.K1, “peed “は、Akt1を発現するHEK293細胞を、SILAC培地で培養し、ラベルを完全に取り込んだ。 70％コンフルエント時に、Tet（1μg/ml）を培地に補充し、Akt1発現を誘導した。 K0R0 標識細胞は、G0 期に細胞を停止させるために広く用いられている方法である一晩の血清飢餓によって G0 期に停止させた42。 これを行うために、通常の完全培養培地を血清除去したRPMIに置き換え、細胞を5% CO2雰囲気中37℃で16-18時間培養維持した。 K8R10で標識した細胞を、真核生物の核DNA複製の可逆的阻害剤である5 µg/mlのアフィジコリンの存在下で一晩培養することにより、G1/S期に停止させた43。 同様に、G2期を停止させるために、400ng/mlのノコダゾールをK6R6標識細胞の培養液に添加し、16-18時間培養を続けた後、細胞をペレット化した。 ノコダゾールは微小管の重合を阻害し、それによって細胞をG2/M期で停止させる44。 停止した細胞はトリプシン処理し、トリパンブルー染色法で個別に計数した。 異なる細胞周期相に停止した細胞は、1500 rpm、10分間の遠心分離によってペレット化された。 細胞周期ごとに複数の細胞ペレットを作製し、使用するまで-80℃で保存した。

SH-tagged Affinity Purification

G0期、G1/S期、G2期に停止した同数のAkt1過剰発現細胞を1：1：1で混合し、IPバッファ（150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7.5; 1% NP-40; 1X protease inhibitor cocktail and 1 mM PMSF）中で氷上に1時間溶解させた。 細胞溶解液は、10,000rpm、4℃で15分間の遠心分離の後、残渣を除去した。 Akt1タンパク質複合体は、各キットのマニュアルにあるように、StrepとHAタグを同時にターゲットにして、並列セットで選択的に精製された。 Strepタグの付いたAkt1タンパク質複合体を100μlのStreptactin磁気ビーズと混合し、4℃の回転式シェーカーで1時間インキュベートした。 非特異的な相互作用物質は、5ビーズ容量のストレプトアクチン洗浄バッファーで5回連続洗浄する間に洗い流された。 Akt1タンパク質とその相互作用物質は、最終的に1回の溶出につき125μlのストレプト溶出バッファー（invitrogen）を用いて2回の溶出ステップで溶出された。 HAタグ付きAkt1タンパク質複合体の精製には、清澄な細胞ライセートを50μlのあらかじめ洗浄したHAアガロースビーズとともに4℃で2時間、回転式シェーカーでインキュベートした。 10ビーズ容量のTBS-Tバッファーで3回素早く洗浄した後、Akt1タンパク質複合体は50μlのHAペプチド（250μg/ml）で3回溶出させた。 上記の精製ステップは、Akt1タンパク質とその相互作用パートナーを精製するために、このような3つの生物学的複製に対して行われ、各複製に対するStrepとHA溶出物はプールされ、凍結乾燥し、さらなる処理まで-80℃に保存した。

タンパク質消化とLC-MS/MS用のサンプル準備

タンパク質消化については3つすべての生物学的複製が別々に処理された。 凍結乾燥サンプルに、40μlの100mM重炭酸アンモニウムを加え、よくボルテックスし、その後、2μlの変性剤バッファー(AB Sciex)を加えました。 4 µl の還元試薬 (AB Sciex) を加え、60 ℃で 1 時間還元した。 2 µl のシステインブロッキング試薬を室温で 10 分間添加し、還元されたシステイン残基をブロックした。 5 µl の 0.1 µg/µl エンドプロテアーゼ Lys C を加えてタンパク質消化を開始し、37 ℃のウォーターバスで4時間インキュベーションした。 短いスピン後、1μlのトリプシン（1μg/μl）をサンプルに添加し、37℃でさらに12～16時間インキュベートし続けた。 タンパク質消化はギ酸(FA)を1滴加えて終了した。

酸分解したサンプルを凍結乾燥し、モノスピンC-18カラムを用いたペプチド精製に供した。 使用前に、C-18カラムはメタノールと水でコンディショニングし、さらに0.1%FA中3%ACNで平衡化した。 凍結乾燥した試料を0.1% FA中3% ACNに溶解し、C-18カラムにロードし、10分間結合させた。 サンプルは完全に結合させるために2回カラムに通しました。 0.1% FA中3% ACNで10回ストリンジェントな洗浄を行った後、消化ペプチドをまず40% ACNで溶出し、次に60% ACNで2回溶出した。 最後に、3つの溶出液をプールし、各レプリケーションごとに凍結乾燥しました。

溶出したペプチドを500 µlの5 mMギ酸アンモニウム (pH 2.5) in 30% ACNに再溶解し、穏やかにボルテックスしました。 陽イオン交換カートリッジは、サンプルをロードする前に固定し、コンディショニングを行いました。 サンプルをロードした後、カートリッジを5 mMギ酸アンモニウム(1 ml)で3回洗浄しました。 ペプチドを30%ACN中400μlの500mMギ酸アンモニウム（pH2.5）で2回再溶解し、溶出液を各サンプルレプリケートごとにプールして凍結乾燥した。

質量分析実験デザインと統計的根拠

LC-MS/MS分析

すべてのサンプルはnanoflexシステム (Eksigent Technologies, AB Sciex) と triple TOF 5600 Mass Spectrometer (AB Sciex; Concord, Canada) を組み合わせたナノフロー液体クロマトグラフィーによって分析されました。 各生物学的複製は、技術的複製として2回注入された。 システムは、溶媒A (0.1% FA中2% ACN) と溶媒B (0.1% FA中98% ACN) の二相グラジエントを使用して運用されました。 最適なサンプルデリバリーの再現性を得るため、オートサンプラーは1 µlループに3 µlのサンプルをオーバーフ ィールするフルインジェクションモードで動作させた。 各サンプル注入の測定では、ペプチドをcHiPLCトラップ、3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0.5 mm × 200 µm (Eksigent) にトラップし、cHiPLCカラム、3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) で300 nl/min 流速、直線グラデーション： 5-60% solvent B 80 minutes, 60-90% for two minutesを用いて分離した。 カラムは90%溶媒Bで6分間洗浄することで再生し、5%溶媒Bで22分間再平衡化しました。

質量分析計はNano Spray Ion Source (AB Sciex) に接続し、Analyst ソフトウェア (v.1.6) でコントロールしました。 イオン源には、10 μm SilicaTip electrospray PicoTip emitter (AB Sciex) を取り付け、溶出したペプチドを以下のイオン源パラメータでモニターした-IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, curtain gas = 25. 質量分析計は、情報依存収集 (IDA) top10モードおよび高感度モードで、MS1およびMS2スキャンの蓄積時間はそれぞれ500および200ms、動的排除は12秒、結果として総デューティサイクルは約2.55秒としました。 ローリングコリジョンエネルギーは、IDAローリングコリジョンエネルギーパラメータースクリプトによって自動的に制御されました。 フラグメント化する親イオンの選択基準は、イオンの強度が150cps以上、質量公差が50mDa、電荷状態が+2～+5であることでした。

Data Processing and Analysis

MS-MS によるAkt1およびその相互作用タンパク質パートナーの取得は、G0、G1/S、G2期という3種類の細胞周期相で行われました。 各フェーズを代表するSILAC標識細胞を3つに分けてプールし、生物学的複製としてプロービングを行った。 各生物学的複製を取得した結果、その技術的複製を表す2つのwiffファイルと2つのwiff.scanファイルが生成されました。 Wiffファイルは、プロテインパイロットソフトウェア、バージョン4.5（改訂番号1656）を使用してUniProtKB/SwissProt Humanデータベース（2015年4月リリース）に対して検索する前に、再び各生物的複製についてプールされた。 参照データベースは、指定されたリリースの20,204のタンパク質エントリで構成されていた。 プロテインパイロット検索は、ソフトウェアのデフォルト統計の一部であるパラゴンアルゴリズムに基づいて行われた。 (a) 種は Homo sapiens、(b) Lys C と Trypsin は異なるランの酵素カテゴリー、(c) Maximum missed cleavages = 2、 (d) 固定修飾は SILAC labels-K6R6 と K8R10 を使用した。 (e)可変修飾はメチオニンでの酸化（protein pilotのデフォルトオプション）、(f)同定はSILAC（Lys + 6, Arg + 6）およびSILAC（Lys + 8, Arg + 10）をサンプルタイプとして、 (g) “Search Effort” parameterは、様々なタンパク質修飾を広く検索する “Thorough ID”, (h) 前駆体と断片イオンに対する質量許容度は0.1, (g)は、”search” parameterは、”search” parameterと同じで、”search” parameterは、”search” parameterと同じで、”search” parameterは、”search” parameterと同じで、”search” parameterと同じである。05、0.1 Da。 各生物学的複製について、SILACラベルごとにLys CおよびTrypsin消化ファイルを作成した。 以下のパラメータを使用してデータをフィルタリングし、その後の解析で信頼性の高いデータセットを得ることができた(a) Heavy to Light比の自動Bias補正アルゴリズムを適用した。 これは、1回の実験で異なる標識サンプルを組み合わせる際の不均等な混合を補正し、実験的または系統的なバイアスを除去するものである。 自動バイアスファクターは、初期タンパク質量の変動を正規化することにより、定量化の精度を向上させる45, (b) フィットから1%のグローバル偽発見率（FDR）のタンパク質を保持した（G-FDR-フィット）。 FDR解析は、プロテインパイロットソフトウェアにインストールされているProteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP)を使用して実施した。 中重度のSILAC標識タンパク質の軽度のものに対する定量比を平均化した。 その後、SILACラベルごとに3つのタンパク質リスト-K0R0, K6R6, K8R10-を取得した。 この後、同定されたタンパク質のユニオンリストを作成した。 定量的な推定は、各SILAC条件について3つの生物学的複製からのファイルをマージすることによって手動でキュレートされました。 3つの複製セットすべてで同定されたタンパク質は、その後の解析のために保持され、これらのタンパク質の軽標識に対する中標識と重標識の間の定量的比率が平均化されました。 その後、K0R0（G0期）、K6R6（G2期）、K8R10（G1/S期）について最終的な結合ファイルが作成された。 タンパク質は、細胞周期のいずれかの段階において、3つの複製セットすべてで同定された場合のみ、最終的なAkt1相互作用リストに含まれる資格がある。

アフィニティーマトリックスやタグ自体との非特異的な相互作用をさらに排除するために、SHタグ付きGFPをHEK293細胞で過剰発現させ、Akt1相互作用分子のリストをプルーンした。 GFPタンパク質と相互作用するパートナーは、Akt1タンパク質複合体について述べたように選択的に溶出された。 Akt1細胞周期期特異的インタラクトームと重複するタンパク質は、非特異的タンパク質としてAkt1インタラクターリストから削除された。 これにより、最終的にAkt1の相互作用パートナーとして信頼できるデータセットが得られた。 Akt1と相互作用するタンパク質に関する情報の要約とその定量的な推定値を補足表3に示す。 これらを各相のAkt1比率で割ると、すべてのAkt1相互作用分子の定量比が正規化される。

Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Western blotting

Akt1 interactorのリストから、CDK1, CCNB1, BUB3, API5 and SH3PX1をランダムに選び、Western BlottingによってAkt1との関連を検証した。 非同期Akt1発現細胞ペレットをIPバッファーで溶解し、前述のようにSHタグをターゲットとしたアフィニティー精製に供した。 溶出液をプールし、1X SDSサンプルバッファーで希釈して10分間加熱し、10% SDS-PAGEで分離した。 タンパク質バンドをニトロセルロース膜に転写し、後者を1:1オデッセイ・ブロッキング・バッファーを用いてブロッキングした。 PBSを用い、室温で1時間ブロッキングした。 次に、メンブレンを切断し、異なるサイズのタンパク質をそれぞれの一次抗体でプローブし、抗HA抗体とともに検証した。 一次抗体の希釈は、オデッセイバッファーで行った。 PBSTで希釈し、4℃、シェーカーで一晩インキュベートした。 十分な洗浄後、ブロットをそれぞれのIR標識抗マウスまたは抗ラビット二次抗体（1:15000希釈、オデッセイバッファーで希釈）にさらしました。 PBSTで希釈した。 バンドはodyssey赤外線スキャナーで検出した。

Dynabeads protein Aを用いて逆共沈も行った。以前に検出したAkt1相互作用体を餌タンパク質として用い、Akt1は抗Akt1抗体を用いてその相互作用パートナーとしてプロービングした。 選択されたAkt1相互作用因子に対する抗体は、別々のチューブで50 µlのDynabeadsと1:20-1:70の濃度で混合し、200 µl PBSTで希釈された。 ビーズ-抗体混合物を室温で 10 分間インキュベートした。 ビーズ-抗体複合体を、磁気分離器を用いてペレット化し、洗浄のために200μl PBSTに再懸濁させた。 その後、250μlのライセートを各チューブに加え、回転式シェーカーで4℃、2時間インキュベートした。 それぞれの抗体-抗原複合体とともにビーズを再びペレット化し、1回の洗浄につき200 µl PBSTで3回洗浄した。 その後、ビーズを50 µlの1X SDSサンプルバッファーで10分間煮沸し、その後冷却した。 上清を10% SDS-PAGEにロードし、ウェスタンブロッティングでプローブした。 抗Akt1抗体は、API5、CCNB1、CDK1、BUB3、SH3PX1の溶出におけるAkt1のプローブに使用された。

GO Classification

各Akt1相互作用体の機能を示すGOクラスはUniProt (http://www.uniprot.org/) とEnrichRデータベース (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/) から決定した。 また、UniProt (http://www.uniprot.org/) とEnrichRデータベース (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/) から、それぞれのAkt1相互作用因子の機能を示すGOクラスを決定した。

Gene Knockdown using siRNA

Standardization

トランスフェクションに最適なsiRNA濃度を決定するために、1.2 × 105 HEK293細胞を12ウェルプレートに播種した。 10nMから50nMの範囲のsiRNA濃度を、供給者のプロトコールに従って、dharmafect transfection reagentを用いてトランスフェクションした。 24時間後、48時間後、72時間後のタンパク質発現レベルの変化をそれぞれウェスタンブロッティングでモニターした（補足図2）。 さらにいくつかのターゲット（SH3PX1、AKT1、CCNB1、SLC25A5）をノックダウンし、ノックダウンの効果をウェスタンブロッティングにより決定した。 GAPDHをローディングコントロールとして用いた。

標的タンパク質のノックダウン

細胞周期のG0からG1/S期へ進行する間にAkt1との関連に異常を示すタンパク質をHEK293細胞で個別にノックダウンしてFACSで調べた。 各siRNAは1x siRNA bufferに再懸濁し、20μMのストック濃度とした。 トランスフェクションは、適切なポジティブおよびネガティブコントロールとともに、細胞播種から24時間後に3連で行った。 各siRNAをRPMIで25nMの実用濃度に希釈し、最終容量を50μlとし、室温で5分間インキュベートした。 同様に、トランスフェクション試薬もRPMIで希釈し、50μlとし、同様の条件でインキュベートした。 siRNAとトランスフェクション試薬の両方を穏やかに混合して複合体を形成し、さらに室温で20分間インキュベートし続けた。 10%血清を含む培地で最終容量を500μlにした。 これらの複合体を細胞上に静かに加え、37℃でインキュベートし続けた。 細胞培養液は24時間後に新鮮な10%培地に交換した。 最後に、トランスフェクションの48時間後に、Nikon Ti倒立顕微鏡下でsiGLOをモニターすることにより、トランスフェクション効率を決定した。

FACS Acquisition and Analysis

トランスフェクション後48時間に、細胞を短く遠心分離し、培地を吸引した。 0.1 mg/ml propidium iodide (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml sodium citrate (Sigma) and 20 µg/ml RNase (Sigma) を含む300 µl propidium iodide solutionで4℃、30分細胞を染色した。 染色した細胞を直ちにBD FACSチューブに移し、BD FACS Cantoで取得した。

得られたデータはFlowJoソフトウェアで解析した。 DNAヒストグラムを解析し、サブG0、G0/G1、SおよびG2/M集団を定量化した。 G0/G1およびG2/M集団でマイナーシフトが観察されたため、これらの集団を解析するために手動ゲーティングを行った。

PDT and RT Calculation

細胞周期のG1、SおよびG2期におけるPDTおよびRTは、G1/S期のAkt1との関連に異常を示すタンパク質群のsiRNAノックダウンにより算出した。 23の遺伝子のPDTを、コントロールとともに、HEK293細胞で72時間にわたってモニターした。 siRNAのトランスフェクションは、翌日、各標的タンパク質について3回に分けて行い、0時間の時点とみなした。 トリパンブルー染色法により、未処理のHEK293細胞について細胞数を測定した。 24時間後、siRNA複合体を含む細胞培養液を、10％血清を含む新鮮なRPMIに交換した。 その後、24時間の時点を表すように、siRNAを導入した細胞のそれぞれについて、細胞数をカウントした。 以後、並行培養している一組の細胞を、48時間および72時間の時点でそれぞれ採取し、計数した。

PDTが摂動遺伝子の標的セットすべてについて決定されると、G1、SおよびG2期について、それぞれについてRT（時間単位）を以下のように算出した。

where; FACSの取得により、細胞の%人口を決定した。

Data Availability

質量分析データは、データセット “Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” としてPRIDEデータベース経由でProteomeXchangeに寄託されました。 ProteomeXchange経由で、ProteomeXchangeの識別子で公開されている。 PXD005557 データセットは12個のrawファイル（wiffとwiff.scan）と関連する18個のタンパク質パイロットファイルから構成されている

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