6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) は様々なコンジュゲーションやバイオテクノロジー応用のプラットフォームとして最も広く研究されているものである。 CPMVは30 nmの正20面体ウイルスで、2つのポジティブセンス1本鎖RNAゲノムからなり、各RNA分子は別々の粒子に封入されている。 CPMVのキャプシドは、2種類のCPサブユニット（small, 24kDa, large, 42kDaと呼ばれる）各60コピーからなり、擬似T=3正20面体対称を呈している。 カプシドの高度な対称性と異種性の存在により、CPMVは、空間分布と多価性の程度の両方を制御しながら、特定の遺伝子および化学工学によって複数の種類の機能性を（5倍または3倍またはその両方で）差別的に導入する驚くべき機会を与える（Uchidaら、2007； Youngら、2008； Steinmetz、2010；Wenら、2016）。 CPMVは感染葉から大量に精製でき、広い温度範囲（60℃まで）、pH範囲3.0-9.0で安定で、いくつかの有機溶媒に耐えられる（Steinmetz et al.、2009年）。 CPMVキャプシドは、活性酵素の制御された固定化に使用される。 無電解めっき（ELD）による金属ナノ粒子の鋳型製作にCPMVキャプシドを利用し、様々なプロセスによる無機化によって、均一な厚さと組成を持つ金属や合金の薄層を製作することができた。 CPMVビリオンは、ナノ電子デバイスまたは電気化学的多重バイオセンサーとしての潜在的用途のために、ボトムアップ、レイヤーバイレイヤー（LbL）アプローチを用いて2次元および3次元構造を制御して構築するためのナノビルディングブロックとして使用される（Culverら、2015でレビュー；Wenら、J.D.C.C.、1994）。 2015a, 2016; Narayanan and Han, 2017a）。

ネイティブCPMVおよびランタニド金属錯体で誘導体化したCPMV粒子は、これらの粒子の生体内分布、毒性および病理学の研究に基づいて、安全かつ無毒であることが判明した（Raeら、2005；Shinghら、2007）。 CPMVは、マウスの中枢神経系（CNS）感染時に、炎症の領域と関連し、血液脳関門の破壊を誘発することが分かった（Shriverら、2009年）。 表面PEG化したCPMVは、低い免疫原性を示し、非特異的結合の減少により、いくつかの細胞種で内在化が防止された（Rajaら、2003年）。 Manchesterと共同研究者は、蛍光標識したCPMVが血管内皮細胞に取り込まれる内因性能力を有し、生きたマウスとニワトリ胚で72時間、最大500μmの深さまで血管系と血流を視覚化するためのイントラビタルイメージングプローブとして使用できることを発見した（Lewisら、2006年）。 CPMVは、細胞の構造と動態を調節する細胞骨格タンパク質である表面のビメンチンと自然に結合する能力を持ち、内皮細胞、癌細胞、炎症細胞に過剰発現していることが明らかになった（Koudelkaら、2009年）。 CPMVの生体適合性、ビメンチンとの自然な相互作用、内皮保持の特徴は、さらに、in vivoでの腫瘍血管新生と腫瘍ホーミングの画像化に利用されている（Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al, 2015a).

CPMVキャプシドの外表面は、標準的な化学的コンジュゲーション法およびAuナノ粒子などのいくつかの試薬を取り付けるためのコンジュゲーション架橋剤を用いて、天然由来のまたは遺伝子工学的に露出したリジン、システイン、チロシン、ならびにアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を用いて広範囲にわたって改変されてきた。 酸化還元反応性メチルビオロゲン部位、有機金属フェロセンカルボキシレート部位、蛍光体、ビオチン、PEG鎖、スチルベン誘導体、炭水化物、異種タンパク質（e．g., ヒトホロトランスフェリン、T4リゾチーム、インターナリンBのLRRドミアン、HER2チロシンキナーゼ受容体のイントロン8遺伝子産物）、抗体、オリゴヌクレオチド、半導体量子ドット、フラーレンなどが挙げられる。 非天然アミノ酸のCPMVキャプシドへの組み込みは、複数の直交化学反応（化学選択的ヒドラゾンライゲーション戦略、銅触媒アジドアルキン環化付加反応（CuAAC）または「クリック」反応など）により実施された。 これらの取り組みにより、CPMV粒子の光プローブ、ワクチン候補、およびメモリおよびセンサーナノデバイスとしての使用が促進された（Youngら、2008；Destitoら、2009；GrassoおよびSanti、2010；Steinmetz、2010；LomonossoffおよびEvans、2011；Wenら、2015a；Zhangら、2016b；Leeら、2017aでレビューされている）。 CPMVおよびTMVは、デュアルモダリティ磁気共鳴（MR）および光学イメージング用の造影剤を運ぶために装填され、両方のモダリティは、標的ペプチドが存在するin vitroでのフィブリン結合の特異性を実証した。 血栓症の頸動脈光化学損傷モデルにおける前臨床研究では、ナノプローブの血栓ホーミングが確認され、細長いTMVロッドは正20面体のCPMVよりも血栓への付着が著しく大きかった（Wenら、2015b,c）。 E7p72ペプチド（ヒト内皮細胞を特異的に標的とする高親和性上皮成長因子様ドメイン7（EGFL7）結合ペプチド）で装飾されたCPMVは、イントラビタルイメージングによって評価されるように高い特異性で腫瘍関連新血管系に標的化した（Cho et al.、2017）＜2994＞＜8386＞CPMVキャプシドサブユニットのインビトロおよびインビボ組立プロトコルはまだよく確立されていない。 これは、カーゴ分子のカプセル化のためのナノコンテナとして使用する可能性を制限している。 CPMVビリオンのネイティブな核酸を静電スポンジとして使用し、簡単な注入技術でイメージング剤や治療分子を引き寄せることができた（Yildiz et al.） 大小のタンパク質が融合したCPMV前駆体（VP60）と、VP60をタンパク質分解する24Kプロテイナーゼを植物で一過性に共発現させると、RNA（ウイルスも宿主も）を全く含まないCPMV VLP（eCPMV）が得られた（Saundersら、2009）。 このような空のキャプシドは、金属、蛍光色素、または薬剤などの幅広いカーゴ分子を運ぶために使用されてきた（Culverら、2015；Wenら、2015a；NarayananおよびHan、2017a）。 蛍光色素、ビオチンアフィニティタグ、PEG、および様々なペプチドは、反応性リジンを標的として空CPMVの内表面に選択的に表示されている（Wenら、2012b）。 eCPMVのin situワクチンとしての有効性は、転移性メラノーマ、乳がん、卵巣がん、大腸がんのマウスモデルで実証され、好中球の活性化と浸潤を誘発し、適応免疫の活性化につながるケモ・サイトカインプロファイルをもたらすことで抗腫瘍免疫反応を誘導しました。 反対側の脇腹に腫瘍を再チャレンジしたほとんどのマウスは、再チャレンジした腫瘍を完全に拒絶した（Lizotteら、2016年）。 温熱療法を誘発するための磁性ナノ粒子（mNP）の腫瘍内投与とeCPMVの組み合わせは、C3Hマウス／MTG-B乳腺癌およびC57-B6マウス／B-16-F10メラノーマ癌細胞モデルにおける局所および全身腫瘍治療効果（二次腫瘍成長の遅延（アブソーパール効果）および腫瘍再チャレンジに対する抵抗）を改善しました（Hoopes他、2017年a）。 8つの自然発生イヌ癌（2つの口腔メラノーマ、3つの口腔アメリオブラストーマ、および1つの癌腫）を使用して、Hoopesら（2017b）は、低分割放射線およびmNPによる温熱療法と腫瘍内eCPMV処理を組み合わせて、免疫反応の強化を誘発することが示されたことを実証した。

がん細胞への薬剤の標的送達のためにCPMVを使用し、CPMVと哺乳類細胞間の自然な相互作用を克服するために、PEGおよび葉酸リガンド部分（CPMV-PEG-FA）をCPMVにコンジュゲートするために「クリック」反応が使用された。 このコンジュゲーションにより、葉酸受容体（FR）を発現するHeLa細胞およびKB細胞へのCPMVの特異的なターゲティングが可能となった（Destito et al.、2007）。 神経芽腫腫瘍細胞へのCPMVのターゲティングは、ターゲティングリガンドとして神経ペプチドY（NPY）アナログを表示するようにCPMVを遺伝子的に改変することによって達成された。 CPMV-NPYは、Y1受容体を過剰発現しているSK-N-MPC細胞と特異的に相互作用することが示された（Destitoら、2009年；Maら、2012年）。 短いペプチド配列（血管内皮増殖因子受容体1（VEGFR-1）に特異的なF56とボンベシン）およびガストリン放出ペプチド受容体（GRPR）をそれぞれCPMVに固定することにより、受容体を標的としたイメージングが実現された。 これらのCPMVを用いたセンサーは、細胞表面にこれらの受容体を過剰発現しているがん細胞に対して特異的に結合することがわかった（Brunel et al.、2010；Steinmetz et al.、2011）。 WenとSteinmetz（2014）は、ターゲティングリガンド（環状RGDペプチド）、および蛍光色素を含むCPMVナノ粒子、二量体および集合体の合成のためのボトムアップアプローチを開発し、RGDペプチドの対称提示およびナノ粒子の二量体化が、がん細胞ターゲティングの効力を高めることを見出した＜2994＞ ＜8386＞CPMV が免疫応答を誘発するいくつかの異種ペプチドの表示にうまく使用されてきた。 このキメラを動物に免疫すると、強い体液性免疫応答が誘導され、それぞれの病原体によるチャレンジに対して保護的であった。 CPMV上の抗ウイルス分子および糖鎖の多価ディスプレイは、治療用途への使用を容易にした（Lomonossoff and Evans, 2011; Koudelka et al, 2015; Hefferon, 2017）。 Aljabaliら（2013）は、CPMVの外表面のリジンまたはシステイン残基を用いたアミド結合またはジスルフィド橋のいずれかを介して、CPMVへのdoxの共有結合を確立した。 このCPMVは、低用量であっても、遊離のドックスよりも高い殺細胞効果を示した。 また、負電荷のデンドロンで修飾したCPMVを用い、正電荷の光増感剤（光線力学療法（PDT）用）を担持させることができた。 このハイブリッドPDT-CPMVキャリアシステムは、in vitroでメラノーマ細胞とマクロファージの両方を殺すのに有効であった（Wen et al.、2016）。 高グルコース誘導ヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC）の増殖をin vitroで選択的に阻害することができる三価クロム（有益なミネラル栄養素）の用量制限非特異的毒性を克服するために、。 塩化クロムをCPMV内腔に注入して担持させ、得られたCrCl3担持CPMV（CPMV-Cr）粒子は高血糖条件下でグルコース誘発HASMC増殖を著しく抑制し抗アテローム効果を示した（Ganguly et al., 2016).