Copaifera 4種の安全性プロファイルとSalmonella/Microsome TestによるKaurenoic acidの検討
Abstract
Copaifera 属の木は中南米と西アフリカの熱帯地方に自生している． Copaifera spは民間薬として広く利用されており，淋病，気管支炎，喘息，皮膚潰瘍，潰瘍，咽頭炎，子宮感染症，一般炎症，癌，リーシュマニア症など様々な民族薬学的適応症を持っている。 カウレノイン酸はコパイフェラに含まれる天然由来のジテルペンであり、抗炎症、潰瘍、リーシュマニア症、癌の治療薬として使用されてきた。 そこで、薬用植物から分離した抽出物、油、植物化学物質の安全性を評価する優れたツールとしてAmes試験があることを踏まえ、Copaifera属の4種、オレオレジン（C. oblongifolia; C. langsdorffii）と葉エキス（C. lucens; C. multijuga）の変異原性、およびその主要成分の一つであるkaurenoic acidについて評価する。 その結果，Copaifera属およびkaurenoic acidは，Ames testで評価したすべての濃度において，実験では変異原性を示さず，復帰コロニー数の増加を誘導しないことが明らかとなった。 本研究で得られた結果は，選択したコパイフェラ属薬用植物およびカウレノイン酸の安全な使用を支持するものであった
1. はじめに
歴史上、さまざまな文化が植物を薬用として使用してきました。 実際、植物は広範な疾患の治療のための医薬品の供給源であることが証明されています。 今日、植物由来のシステムは健康に不可欠な役割を果たし続け、植物性薬用製品への関心は世界中で高まっており、そのため、植物は新規薬用剤の源として今も研究されています。
コパイフェラ属に属する木は、中南米と西アフリカの熱帯地方に自生しています。 コパイフェラ属はマメ科に属し、72種が含まれる。 ブラジルには20種以上のコパイフェラ属の木があり、「コパイラス」、「パウ・ドレオ」、「コパイバス」などと呼ばれている。 コパイフェラ種は広く民間療法に利用されている。 淋病、気管支炎、喘息、皮膚潰瘍、潰瘍、咽頭炎、子宮感染症、一般炎症、癌、リーシュマニア症の治療のように、様々な民族薬理学の適応症を持っている .
科学文献には、コパイフェラ種の薬理作用について、抗炎症、抗腫瘍、抗増殖、駆虫、抗結核、胃腸保護、化学予防、免疫調節、抗菌作用など、数多くの報告があります。 カウレノイン酸は、抗炎症作用、潰瘍の治療への利用、抗寄生虫作用、鎮痛作用、抗がん作用など、数えきれないほどの薬理作用が報告されています。 しかし、伝統医学に応用されているいくつかの植物種が、変異原性、発癌性、または毒性作用を示すことが多くの研究で報告されています。 それにもかかわらず、多くの植物やフィトテラピー製品が、その安全性について科学的な証拠がないまま適用され続けています。
エームス試験は、異なる薬剤による点変異を発見する能力で世界的に知られています。 この試験では、異なるタイプの突然変異を誘発する物質に感受性のあるサルモネラ・チフスムリウム株を指標としています。 エイムズ試験に基づいて、化合物の変異原性作用を S. Typhimurium 濃度の関数として確立することが可能である。 このアッセイは、世界中の新薬の変異原性スクリーニングに利用されています。 変異原性反応は、発がん性の高い予測値です。 長年にわたり、科学界や政府機関、企業はこの試験法の価値を認めてきました。
薬用植物から分離したエキス、オイル、植物化学物質の安全性を評価する優れたツールとしてエームス試験があることを念頭に、この試験を使ってコパイフェラ4種のオレオレジンまたは葉エキスとカウレノ酸の変異原性ポテンシャルを評価しました。 植物材料
植物材料は、2012年8月から2014年5月の間にブラジルの異なる州で採取された。 植物標本は，ブラジル農業研究公社（Embrapa）植物研究所のRegina Celia Vianna Martins da Silva博士（ブラジル，パラー州，ベレン）またはサンパウロ大学生物学部のMilton Groppo Junior博士（ブラジル，サンパウロ州，リベイラオプレット校）によって確認し，標本は預け入れられた。 表1に標本に関する情報を示す。
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(a)
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< 0.05 (ANOVA); < 0.01 (ANOVA); M ± SD = 平均値と標準偏差; Negative Control: 自然復帰率; Solvent Control: ジメチルスルホキシド (DMSO, 100 μL/plate); Positive Control (C+); a 4-nitro-o-phenylenediamine (10.0 μL/plate).0μg／プレート、TA98およびTA97a）；b アジ化ナトリウム（1.25μg／プレート、TA100）；c マイトマイシン（0.5μg／プレート、TA102）、S9の不在下；およびd 2-アントラミン（1.25μg／プレート、TA98、TA100およびTA97a）；e 2-aminofluoren (10.0μg/plate, TA102) 、S9の存在下にあるとき。 括弧内の値（MI）≧2は変異原性を示す。
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C. lucens と C. multijuga 葉エキスも C. langsdorffii と C. oblongifolia オレオレジンもエームス試験によって明らかになったように遺伝子突然変異を起こさないことがわかった。 また，Kaurenoic acidは復帰コロニー数を増加させなかったことから，いずれの濃度においても，またいずれの評価菌株においても変異原性作用を示さないことが明らかとなった． 溶媒対照（DMSO）は陰性対照と復帰体数に有意差はなかった。 考察
植物が発揮する変異原性作用は、ヒトではなかなか自覚できず、癌などの長期的な悪影響が現れることがあります。 そのため、科学文献は薬用植物の変異原性スクリーニングの重要性を強調している 。 この意味で、ここではコパイフェラ属植物とカウレノイン酸の変異原性ポテンシャルをAmes試験の助けを借りて検討した。 Akyııl と Konuk は、遺伝毒性物質の検出は、しばしば細菌を試験生物として使用することに依存していることを強調した。 このように、エイムズ試験（またはサルモネラ／ミクロソーム試験）は、遺伝毒性剤の変異原性効果を検出するために最もよく使用される方法である。
異なる株を用いたエイムズ試験の性能は、試験に対するそれぞれの株の特異性を考慮すると非常に重要である。 このように、TA100株のhisG46マーカーは、ロイシン（GAG/CTC）がプロリン（GGG/CCC）に置換されたものである。 この変異は、主にGC対の一方に塩基対置換変異を引き起こす変異原によって野生型に戻される。 TA98株の持つhisD3052変異は-1フレームシフト変異であり、近傍の繰り返し配列である-C-G-C-G-C-G-G-の読み枠に影響を及ぼしている。 この変異は、2-ニトロフルオレンやアミン系発癌物質の芳香族ニトロソ誘導体などのフレームシフト変異誘発物質によって野生型に復帰することが知られている。 TA97a株のhisD6610変異は、+1フレームシフト変異（シトシン）を持ち、6シトシンのラン（-C-C-C-C-C-）となる。 この株は、TA98株を復帰させる変異原のいくつかに対して、より感受性が高いと考えられている。 TA102株は、hisG428変異部位にAT塩基対を含むように開発された。 この変異は、マルチコピープラスミドpAQ1上に担持されている。 このプラスミドはテトラサイクリン耐性を付与し、プラスミドの存在を検出するための便利なマーカーである。 hisG428突然変異はhisG遺伝子における黄土色の突然変異、TAAであり、これは6つの可能な塩基対の変化すべてによって復帰することができる；転移と転化の両方である。 この突然変異は、架橋剤を検出する以外にも、酸化的損傷を引き起こす突然変異誘発剤によっても復帰する。 同様に、不活性な化学物質が活性な代謝物に変化することもあります。 したがって、エイムズ試験においてS9フラクションを用いることは重要であり、代謝の存在下で分析を行うことができるため、より信頼性の高い結果を得ることができる。
ここで、安全性に関して、我々の知見では、S9の活性化にかかわらず、カウレノイン酸および調査した植物（抽出物とオレオレジン）はSalmonella Typhimuriumの異なる株で変異原性効果を発揮しなかった。 しかし、葉の抽出物を研究することも、有望な生理活性分子を含んでいるため、関連性があると考えられます。 実際、葉を煎じることで病気を治そうとしたことは、天然物を利用する最初の方法の一つであったと思われ、この方法は現在でも採用されています。
多くのコパイフェラ属植物は、多くの薬理特性を示すことから、各国で薬草として広く利用されています。
私たちの研究は、C. lucens と C. oblongifolia の安全性について調査し、C. langsdorffii をオレオレジンで使用して変異原性の研究を行った最初のものである。 C. multijuga（オレオレジン／エキス）のDNAへの影響については、過去の研究でも取り上げられているが、Ames試験を用いた我々の研究とは異なる手法を用いたものであった。 このように、我々の結果は、コパイフェラの他の種およびその化学成分を試験し、あるいは異なる実験モデルを用いて、それらがDNAを損傷しないことを実証した他の著者らによって発表されたデータと一致する
このようにして、C. multijugaのオレオレジンは、DNAを損傷しない。 multijugaのオレオレジンおよびその化学マーカーであるジテルペン・コパル酸について、Alvesらはin vitro試験として小核試験（V79細胞）およびAmes試験、in vivo試験として小核試験およびコメット試験（スイスマウス）で評価しました。 その結果、採用した実験条件下では、いずれも遺伝毒性／変異原性作用を示さないことがわかった。 我々の結果と比較すると、C. multijugaについては、我々の研究で評価した抽出物もAlvesらの評価したオレオレジンも、Ames試験において陰性対照と比較して復帰コロニー数に影響を与えないこと、コパル酸およびカウレノイン酸についても同様であることが示唆された。 FurtadoらはC. multijugaの遺伝毒性を評価し、C. multijugaのオレオレジンおよび葉エキスで処理しても、in vitro（V79細胞）およびin vivo（スイスマウス）で小核の頻度が有意に増加しないことから、DNAへの損傷がないことが示されました。 さらに、著者らは、C. duckei、C. reticulata、C. paupera、C. pubifloraなど、この属の他の種の抽出物とオレオレジンも評価し、C. multijugaで見つかった結果と同様に、試験したすべての種で遺伝毒性がないことが報告された。
AlvesらとBatistaらの研究で得られた結果は、C. langsdorffii抽出物は、それぞれ末梢血と骨髄における小核の頻度（スイスマウス）を有意に増加しないことを実証しました。 また、Wistarラットを用いたコメットアッセイでは、C. langsdorffiiエキスのみを投与した動物と陰性対照群との間に有意差は見られなかった。 また、Wistarラットを用いたin vivo小核試験およびコメットアッセイにより、Copaifera malmei抽出物は遺伝毒性がなく、抗変異原性活性を有することが示されました。 さらに、亜慢性毒性試験では、30日までの行動学的、生化学的、血液学的分析から判断して、毒性学的に関連する変化は見られなかった。 これらの結果から、Copaifera malmei抽出物は治療用として高い安全性を持つことが示唆された。 毒性および遺伝毒性測定により、コパイバオイルの使用も安全であることが証明されました。病理組織学的評価では、コパイバオイルを投与した動物に変化は見られず、変異原性評価（小核試験、2000 mg/kg b.w.）では遺伝毒性効果は見られませんでした。
LeandroらはAmes試験により、代謝の活性化に関係なく、C. trapezifolia抽出物は本書で試験したSalmonella Typhimurium菌に対して変異原性を持たないことを示しました。
様々なコパイフェラ種の化学組成に関連して、オレオレジンのUPLC-MS/MSおよびCG/MS分析により、酸性ジテルペンおよび主要な揮発性セスキテルペンが特定され、一方、葉にはフラボノイドヘテロシドとガロイジン酸誘導体を含むフェノール化合物の高い含有量が確認されました。 オレオレジン成分のうち、ジテルペン類が圧倒的に多く、ent-agathic acid, ent-copalic acid, ent-kaurenoic acid などに続き、β-bisabolene, α-humulene, trans-β-caryophyllene などのセスキテルペン類が含まれる。 コパイフェラ種の葉のアルコール抽出物の場合、主にケルセチン、アフゼリン、キナ酸が含まれている。 コパイバオレオレジン（市販品）とそのフラクションは、セスキテルペン、ジテルペンカルボン酸のメチルエステル、高いβ-カリオフィレンを含んでいますが、in vivoコメットアッセイまたは小核試験で証明されたように、遺伝毒性はないとされています。 オレオレジンおよび揮発性画分の主成分であるβ-カリオフィレンは、ヒトリンパ球の培養において細胞毒性および遺伝毒性作用を促進せず、エチルメタンスルホン酸によるDNA損傷から保護された。 トランス-カリオフィレンを含む9つのセスキテルペンをエームス試験で評価したところ、どの化合物も変異原性がないことが示されました。
最近の研究では、胃がんおよび正常胃粘膜細胞株をカウレノイン酸で処理すると、酸濃度とDNA損傷指数および小核頻度にそれぞれコメット試験および小核試験による強い相関があることがわかりました …。 一方、Cavalcantiらは、C. langsdorffiiから抽出した生理活性ジテルペノイドである低濃度のカウレノイン酸は、V79細胞においてもDNA損傷を与えず、小核の頻度も変えないことを報告している。 そこで、Salmonella Typhimuriumの各菌株に対する毒性を、毒性限界から始まる酸濃度を用いて検討したところ、30μg/mL、60μg/mLで有意なDNA損傷の増加が認められました。 kaurenoic acidの濃度が高いほど菌の増殖が阻害されるため、この化合物の変異原性を評価することが可能となった。 この結果に基づいて、本書で試験したオレオレジンは、測定した最高濃度においても変異原性がないことが判明しました。 これは、遺伝毒性および変異原性試験系が2つのグループに分けられるためである。 細胞遺伝学的手法は真核生物を分析し、遺伝子変異から染色体損傷、異数性まで様々な情報を得ることができる。 一方、細菌法は原核生物を分析し、遺伝子変異や薬剤による一次的なDNA損傷の情報を得ることができる。
ファーガソンによれば、小核試験で使用される物質のように、哺乳類細胞の場合、物質がクラストジェニックである可能性があるとのことである。 しかし、同じ物質でも、エイムズ試験のような細菌試験では陰性となることがある。 このように、植物やその化合物の安全性を評価するためには、遺伝子の損傷の種類に着目することが重要である。 Ames試験とin vitro哺乳類細胞試験との関連は、いくつかの必須変異原性パラメータ（遺伝的変異、構造的染色体損傷、異数性）をカバーでき、原核生物系および真核生物系の試験もカバーできることから推奨されている。 さらに、この文献では、細菌遺伝子突然変異試験では、遺伝子突然変異に特異的につながるすべての関連する作用様式を検出するため、エームス試験による研究を省略すべきではないことも強調しています。
以前の研究では、化合物は哺乳類細胞株の1つ以上でのみ陽性であり、つまり、陽性結果はエームス試験やin vivo試験からは支持されないことが観察されました。 実際、エームス試験で最初に得られた結果は、その後、動物を使った試験でも再現される。したがって、エームス試験で変異原性が認められないことで、副作用の少ない新薬の生産が可能になった。 これらのデータから、私たちのようにAmes試験で植物の変異原性とその主成分がないことを証明する研究の重要性が浮き彫りになりました。 結論
全体として、我々の結果は、コパイフェラ属に属する選択された薬用植物の安全な使用を支持するものである。 しかし、単一の化合物の変異原性効果は、抽出物またはオレオレジンに含まれる他の化合物の拮抗作用によってマスクされる可能性がある。 このように、我々の知見は、カウレノイン酸と評価された薬用植物の両方が、治療用として潜在的に安全であると考えられることも示している。
情報公開
Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende, and Jaqueline Lopes Damascenoは研究の全データにアクセスし、データの完全性とデータ分析の正確性について責任を負います。
利益相反
著者らは、開示すべき利益相反はない。
著者らの貢献
YadiraフェルナンデスArnet、Giovanna Capaldi Fortunato、Luiza Girotto、Gabriel Davi Marena、Beatriz Patti Rocha、Flávia Aparecida Resende、Sergio Ricardo Ambrosio、Rodrigo Cássio Sola Veneziani、Jairo Kenupp Bastosは構想および設計、データ収集、解析および解釈に実質的な貢献を行っている。 Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende, and Carlos Henrique Gomes Martinsは、原稿の起草、または重要な知的内容についての重要な改訂に携わりました。 Carlos Henrique Gomes MartinsとFlávia Aparecida Resendeは、本研究のすべての側面について説明責任を負うことに同意した。 9062>
謝辞
著者らは、CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel), CNPq (National Council for Scientific and Technological Development), and São Paulo Research Foundation (FAPESP, Grants nos. 2011/13630-7 and 2012/25237-0) による財政支援とフランカ大学に謝辞を述べた。 Jaqueline Lopes DamascenoはCAPES（Coordination for the Improvement of Higher Level or Education-Personnel）Doctorate Fellowshipを受賞した。