Comparative genomics of Salmonella Enterica serovar Enteritidis ST-, and the American Societies in Uruguayウルグアイで分離された11株は特定の疫学的形質と関連する系統を明らかにした
Comparative genomics
まず、P125109ゲノムを参考にSNP解析によりウルグアイの61株を比較検討した。 その結果、最も古い2つの分離株は参照ゲノムと比較して600以上のSNPsの違いがある（31/88と08/89はそれぞれ607と652）のに対し、他の59株はすべて200以下のSNPs（60から166）であった（Supplement Table 1）。 一方，ウルグアイの全ゲノムはP125109ゲノムと17のSNPsを共有していた。
SNPsに基づく系統解析の結果，61株中57株を占めるE1およびE2と名付けた二つのクレードが存在することがわかった（図1（b））． これらの57株は、主要なS. enterica serovar Enteritidis MLST配列タイプ11（ST-11）に属し、1994年から国内で共流行するようになった株である。 残りの4株（31/88, 8/89, 77/02, 89/02）は、いずれのクレードにも属さなかった（図1（b））。 最も古い2株（31/88と8/89）はMLST配列型1974（ST1974）に属し、ST1974は特徴的なプロファージを獲得した後にST11から発生したことを我々は以前に報告した8。 その他の2株（77/02、89/02）は大多数がST11に属している。
E1クレードは5つの疫学期間のすべてにわたって、食品、動物、ヒトの感染から分離された21株から構成されている。 一方、E2クレードは36株で、そのうち34株は流行期に分離されたものである（図1（a）、（b））。
以前、我々は全世界のS. Enterica serovar Enteritidis EBG4分離株のうち、セロバー内の多様性を示す203株の系統解析を報告したが、その中には本研究で用いたウルグアイの61株のうち6株も含まれていた8。 その結果、6株のうち半数がE1、半数がE2（E1：53/94, 206/99, 214/02, E2：8/02, 251/01, 253/01）であり、それぞれ欧米由来の株と近縁であることが判明した。 この関係は、既報の系統樹にこれらの菌株が形成するクレードを拡大した補遺図S1に示されている。 この仮説を支持するために、アルゼンチンから12株、ブラジルから122株、ウルグアイから同じ61ゲノムを含む、この地域で分離された株を対象に系統樹解析を行った（図2（a））。 E1クラスタにはアルゼンチンとブラジルの株が含まれ、E2クラスタにはブラジルの株（E1：103株、E2：62株）が含まれています。 アルゼンチンについては、EnteroBaseに登録されているゲノム数が少ないことから、E2系統がアルゼンチン国内で循環している可能性も否定できない。 また、E1,E2以外のグループに属する株は3カ国合わせて30株であり、そのうち24株は1994年以前に分離された株である（図2（a）、補足表2）。 以上のことから、E1株とE2株は1994年頃にこの地域に導入され、その後ウルグアイ、ブラジル、アルゼンチン、ヨーロッパ、北米で循環していることが強く示唆され、両者がSerovar Enteritidisの系統を構成していることが示唆される。
(a) ウルグアイ61（白葉）、アルゼンチン12（水色葉）、ブラジル122（黄色葉）を含む195のゲノムの系統樹。 E1系統の枝は青色で表示されています。 E2系統の枝は赤で示した。 右のレーンは、ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas, aceA の対立遺伝子変異をそれぞれ異なる色で示す。 (b)内のカラーレジェンドを参照。 スケールバーの単位は変異体1部位あたりの変化量を表す。 (b) ycdX, pduD, hsdM, ybiO, yiaN, aas, aceAそれぞれの異なる対立遺伝子変異体の遺伝子アラインメント。 遺伝子は、各変種を含むゲノムに注釈され、参照番号P125109に整列された状態で描かれている。 塩基対（bp）単位のアラインメントのスケールは横棒で示す。 各バリアントの参照ゲノムに対するSNPsの詳細は表1に示す。 非同義変異を引き起こすSNPは、遺伝子内の位置に対してX→Y（一文字のアミノ酸コード）のように表示されている。 9828>
次に、E1系統とE2系統に関連する遺伝的差異を明らかにする目的で、165ゲノムを含む比較ゲノミクス分析を実施した。 ウルグアイ57株、アルゼンチン11株、ブラジル97株（図2（a））。
E1系とE2系の対立遺伝子
E1系とE2系の間で付属ゲノムに違いが見られなかったため、選択した165株でSNPの違いを探した。 この解析の結果、E1とE2の主な違いはycdX、pduD、hsdMの3つの遺伝子にあることが分かった。 これらの遺伝子は、E1ゲノムではE2ゲノムの対応する遺伝子と比較して、途切れていることがわかった。 さらに、他の4つの遺伝子、ybiO、yiaN、aas、aceAにも各系統に特異的な対立遺伝子変異が見つかった（図2（a、b）；表1）。
E1系統103株（アルゼンチン11株、ブラジル71株、ウルグアイ21株）すべてに、基準株およびすべてのE2系統と比較して、遺伝子ycdX（SEN1912）に4塩基対の挿入が認められる（表1）。 この挿入により、早発停止コドンが導入され、擬似遺伝子やタンパク質の切断型が生成される可能性がある（図2（b）および表1）。 ycdX遺伝子は、NH2末端にphpドメイン（polymerase histidinol phosphatase）を持つPHPタンパク質のスーパーファミリーに属するヒドロラーゼをコードしている。 このドメインは細菌のDNAポリメラーゼIIIアルファサブユニットに特徴的であり、プルーフリーディング機能に関与している22。 YcdXは大腸菌のDNA修復経路に関与しており、これらの経路でヌクレアーゼまたはホスファターゼとして働く可能性が示唆されている23。 最近、Wang らは、卵白中での生存能力が著しく異なる S. Enterica serovar Enteritidis 分離株の間で、この遺伝子の 2 つの対立遺伝子変異（非同義 SNP）を発見した24。 井上らはycdY（ycdWXYZオペロンの隣接遺伝子）の変異が大腸菌のswarmingの抑制を引き起こすことを示した25。 pduDはプロパンジオールデヒドラターゼをコードしており、1,2-プロパンジオールの異化に必要なタンパク質をコードするpduオペロンの一部である（図2（b）および表1）。 このオペロンは、サルモネラの側方遺伝子導入によって獲得されたものであり26,27、ヒトの腸管外侵襲性感染症を引き起こす様々な血清群、例えば Typhi や Paratyphi A などで破壊されている28。 Faberらは、1,2プロパンジオールは嫌気性腸内環境における代謝産物であり、テトラチオン酸嫌気性呼吸と結合することでサルモネラが利用できるため、このオペロンの機能は腸内細菌叢との競合に重要である可能性があると報告している29。 また、E2株はすべてhsdM遺伝子の対立遺伝子（SEN4290）が同じであるが、E1株にはいくつかの対立遺伝子が存在する（図2（b）、表1）。 E1株の多くは、タンパク質の切断型（6変異体中4変異体）または非同義置換を生じるようなhsdMの変異体を含んでいる。 E1のうちE2と同じ変異体を持つのは3株（ウルグアイ44/07を含む）のみであり、E1株においてのみhsdMは変異を蓄積しやすいことが示唆された（図2(b)）。 hsdM遺伝子は、腸内細菌のタイプI制限修飾系(RM)に関与するDNAメチラーゼをコードしている30,31。 これまでの報告では、サルモネラ菌の2型制限修飾系は、病原性遺伝子発現に対するエピジェネティックな影響により病原性と関連していた32。 Silvaらは、RM遺伝子の変異が侵襲性サルモネラ症モデルマウスに障害表現型をもたらすことを示している33。 また、Type 1 RMシステムはYersinia pseudotuberculosisの病原性に関与していると報告されている34。
E1ではなくE2がycdX、pduD、hsdMをそのまま持っており、これらの遺伝子が以前にサルモネラ病原性に関係していることを考えると、E2株の流行性にこれらの3遺伝子が関係していると考えることができる。 また、セロバー内の多様性を表すグローバル系統樹（補足図1、文献8）において対立遺伝子変異を調べたところ、優勢な対立遺伝子はいずれもE2対立遺伝子であり、破壊された変異はE1に特異的であった（データなし）。
上記のように、両系統間で配列がわずかに異なる別の4遺伝子ybiO、yiaN、aas、aceAが見いだされた。
すべてのE2株は、Gly(601)→Argの置換によるybiO遺伝子（SEN0772）の変異を有していた（図2（a）、表1）。 ybiO 遺伝子は、大腸菌の低浸透圧ショックで活性化される浸透圧適応に関与する機械感受性チャネル タンパク質をコードしている35 。 S. Enterica serovar Enteritidis のうち、卵白中での生存能力が異なる 2 種類の対立遺伝子が存在することが報告されている24。 yiaN (SEN3494) (L-dehydroascorbate transporter large permease subunit, a putative membrane protein) については、すべてのE2ゲノムでE1に対してGly(163)→Alaが異なる同一の対立遺伝子が存在する。 同様に、aas (2-acylglycerophosphoethanolamine acyltransferase/acyl-ACP synthetase, SEN2853) と aceA (isocitrate lyase, SEN3966) 遺伝子についてもすべてのE2が同じバリアントを有している。 E1では、ほとんどの株が参照と同一のaas遺伝子を持ち、少数の株が非同義置換（5株）または同義置換（1株）を有している（図2（a）、表1）。 同様に、aceA遺伝子は1株を除くすべてのE1ゲノムで参照と同一である。
以上のことから、yobiO、yiaN、aasおよびaceAに関するE2対立遺伝子はこの系統に特異的であることが判明した。