mecA gene PCR

mecA gene中の 188-bp fragment と S. Resistant S. aureus中の 178-bp fragment を検出。 mecA陽性株はSYBR greenの融解温度が79℃であったのに対し、S. aureus特異的Sa442遺伝子は178bpであり、それぞれMec-SとMec-A、Sa442-FとSa442-RSのプライマーで、LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) で別々の反応をさせ、増幅した（5）。 Sa442陽性の分離株も79℃のSYBRグリーン融解温度を生成する。 Sa442遺伝子のコントロールとしてS. aureus ATCC 29213（オキサシリン感受性）およびS. aureus ATCC 43300（オキサシリン耐性）を、mecA遺伝子のコントロールとしてそれぞれ陰性および陽性として使用した。 対照とは対照的に、分離株1および2ではmecAおよびSa442産物が生成されなかった。 mecA遺伝子のより大きな533bp断片を検出するために、追加のPCRを行った(4)。 分離株1、2およびS. aureus ATCC 29213では生成物が得られなかったが、S. aureus ATCC 43300からは期待されるサイズの生成物が得られた。 陽性対照として用いた16S rRNA遺伝子は，すべての株から増幅された（data not shown）。

S. aureusのメチシリン耐性を正確かつ迅速に検出することは，臨床微生物学研究室の重要な機能である（20）． PCRによるmecA遺伝子の検出がゴールドスタンダードであるが、PBP2aラテックス凝集反応は、一部の症例で事前の誘導が必要であるにもかかわらず、黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の両方でメチシリン耐性を検出できる、シンプルで迅速な検査であり、良好な性能特性を持つことが示されている（1, 21）。 PBP2a法は、PBP2aに対するモノクローナル抗体で感作されたラテックス粒子を用いる(11)。 この試験の特異度は100%に近いと報告されている(18, 19)。 S. intermedius分離株に対するPBP2aラテックス凝集測定法の性能に関する報告はないが、2株のS. warneri分離株でPBP2aの偽陽性が認められた（1株は1分、もう1株は6分、いずれもmecA PCR陰性、オキサシリンMICは0.5 μg/ml以下）（21）。 メーカーの添付文書によると、偽陽性反応は一般に弱い膠着反応で、新鮮な培養物による再検査で陰性となることが多い。 しかし、我々の分離した2株は複数回の継代培養で繰り返し陽性となり、そのうち1株は強陽性であった。 S. intermedius ATCC 29663株は、実際、PBP2a試験で陰性であったが、マンニトール発酵陽性、β-ラクタマーゼ陰性、ペニシリン感受性に関しても臨床2株と表現型的に異なっていた（結果は示していない）。

コアグラーゼ陽性は、Staphylococcus属の分離株に臨床的意義と病原性を付与するために一般的に用いられている。 臨床検査室で分離されるコアグラーゼ陽性ブドウ球菌はS. aureusが最も多いが、S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae, S. hyicusの一部株もコアグラーゼ陽性である (1). 検査室では、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌を同定するために、プロテインAを含む遊離コアグラーゼまたはクランピングファクターを検出する検査と含まない検査を組み合わせて使用することが多い。 S. intermedius分離株は、遊離コアグラーゼは陽性だが、プロテインAは陰性であり、分離株の14％がクランピングファクターを有していることから、分離株1のスライドコアグラーゼ陽性とBACTiスタフラテックス弱陽性を説明できると考えられる（6）。 先に述べたように、ピロリドニルアリールアミダーゼ陽性は、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌がS. aureusでないことを迅速に判断する方法であることがわかった(10)。 また，コアグラーゼ陽性ブドウ球菌は黄色ブドウ球菌と一括りにされることが多いため，ヒトの創傷感染症におけるS. intermediusの真の発生率は過小評価されていると考えられる(17)． S. intermediusを表現型や生化学的手法で明確に同定できない場合、16S rRNA遺伝子の配列決定がStaphylococcusおよびMacrococcus種の分類に有用であることがわかっている（8）。

1989年の最初の研究では、犬の歯肉および犬による創傷感染から分離したS. intermedius株の72％がpenicillinに感受性であり、oxacillinに対する耐性は皆無であった（16）。 最近の研究では，S. intermediusのオキサシリン耐性が問題となっており，犬の鼻，眼，膿瘍からの分離株では，他の部位からの分離株に比べて60〜85％高いオキサシリン耐性率が認められている（7）． また，メチシリン耐性S. intermediusによる最初のヒト感染例（肺炎の原因菌）では，オキサシリンMICが32 μg/mlであった（3）。 本菌はいずれもペニシリン耐性でβ-ラクタマーゼ陽性であり，オキサシリンMICは0.125 μg/mlであった。 これらの菌株のペニシリン耐性は，mecA PCR陰性によるオキサシリン耐性やβ-ラクタム/β-ラクタマーゼ阻害剤の併用感受性の欠如から，β-ラクタマーゼアッセイの陽性所見で説明できる． Gortelらは、mecA遺伝子の533bp断片を標的としたプライマーセットを用いて、犬から分離したブドウ球菌にmecA遺伝子がメチシリン耐性を付与していることを確認した(4)。 この研究者らは、mecAを持つコアグラーゼ陽性ブドウ球菌10株のうち、9株がS. aureusで、1株がS. intermediusであることを見出した。 彼らは、S. intermediusのメチシリン耐性率がS. aureusと異なるのは、種間のmecA制御の違い、あるいはS. intermediusに強い抗生物質選択圧がないためと仮定している（4）。 黄色ブドウ球菌以外のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌に対するNCCLSの解釈基準は存在しないが，表現型および遺伝子型（188および533bp断片を標的とした2つのプライマーセットを用いたmecA遺伝子PCR）法によるオキサシリン感受性試験の結果と，オキサシリン耐性菌の既報値に比べ低いオキサシリンMICの組み合わせにより，S. intermediusはS. aureusと同程度に高い感受性を示した． 8808>

S. aureusのメチシリン耐性は、主にmecA遺伝子にコードされる追加のペニシリン結合タンパク質PBP2aの獲得に起因することがよく知られている。 mecA遺伝子の起源を探った結果、動物の常在菌であるS. sciuriに進化的な前駆体が存在する可能性が判明した。 S. sciuriのmecAホモログは、S. aureusのmecA遺伝子と79.5%のDNA配列類似性を示し、PBP2aと88%のアミノ酸類似性を有していた。 S. sciuriのmecAホモログは、自然界ではメチシリンに対する耐性を付与していない。 しかし、Coutoらは、構造遺伝子の上流にIS256エレメントを挿入したり、プロモーター領域の1塩基を変更したりしてmecAホモログを過剰発現させ、機能的にPBP2aに類似したタンパク質を生産するヒトからのメチシリン耐性S. sciuri分離株を同定している(2)。 S. sciuriと同様に、今回分離されたS. intermediusもPBP2a様タンパク質をコードするmecAホモログを持ち、PBP2aラテックス凝集試験で交差反応を示すがメチシリン耐性は付与されないと思われる。 また、全く関係のないタンパク質との抗原性模倣も可能である。 8808＞＜214＞結論として，S. intermediusの2株についてPBP2aの偽陽性を初めて報告し，表現型検査の解釈における初期誤差と相まって，MRSAと誤同定させるに至った． PBP2aの偽陽性結果は、感染制御の方向を誤り、バンコマイシンなどの抗生物質を不必要に使用し、病院経費の全体的な増加につながる可能性があります（20）。 これらの事例は、報告ミスを避けるために、検査結果の不一致を積極的に追及することの重要性を強調している。 コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の正確な菌種同定は，臨床分離株の病原性，臨床的意義，感受性パターン，疫学を明らかにするために不可欠である

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