STRUCTURAL BASES FOR MECHANISM OF ACTION

rRNAサブユニットの中で大腸菌の16S rRNAはよく研究されており、特に各種アミノグリコシド抗生物質の16S rRNAとの相互作用とmRNAがポリペプチドに翻訳する過程への影響について精査されている(35). 酵母やテトラヒメナなど、他の生物にも同様のrRNA構造が存在する(33)。 rRNAをアミノグリコシドで処理すると、rRNA中のいくつかの核酸塩基が化学修飾から守られることから、これらの分子はrRNA中の特定の部位に高い親和性を持つことが示唆されています。 この結合様式をNoller(35)は、酵素の活性部位に結合してその活性を阻害する酵素阻害剤の様式になぞらえたのである。 アミノグリコシド系抗生物質の異なるクラスは、両者の構造的相補性によって、rRNA上の異なる部位に結合する。 例えば、ネオマイシン、パロモマイシン（図1）、ゲンタマイシン、カナマイシンは、大腸菌の16S rRNA上のAサイトに同様に結合すると考えられ、ケミカルフットプリント実験（図2）において塩基A1408およびG1494を保護することが示された（33）。 rRNAのAサイトには、A1408, A1492, A1493, G1494の4つの塩基が、親和性は異なるものの、tRNAと相互作用している。 前述のアミノグリコシドがデコーディング領域のAサイト（コドンやアンチコドンの認識部位）に結合すると、翻訳中のrRNAによる同族tRNAの正確な認識を阻害する（35）。 また、これらの相互作用は、AサイトからペプチジルtRNAサイト（Pサイト）へのtRNAの移動を妨害すると考えられている

Puglisiら（12-14, 39）は最近、ネオマイシンクラスの代表的アミノグリコシドであるパラモマイシンと大腸菌16S rRNAのAサイト領域を模して設計した27塩基RNAテンプレートの相互作用様式に関する構造証拠を示した（図3A）。 RNAテンプレートの設計は、パロモマイシンがC1407 – G1494塩基対、A1408、A1493、U1495と相互作用し、これらの塩基が高親和性結合に絶対必要であるというこれまでの知識に基づいている（39）（図3Aのグレーで示す）。 さらに、A1492の存在による内部ループ領域の非対称性によって作られるポケットや、下部ステム領域でのC1409-G1491の塩基対などの構造的特徴も重要である。 これらの構造的特徴が総合して、パロモマイシン（後述）の結合に最適なポケットを作り出している

ネイティブAサイトRNA鋳型では、ステムはU1406 – U1495（非正規）およびC1407 – G1494で塩基対の相互作用を有する（図3A）。 パロモマイシンが結合すると、A1408、A1492、A1493によって形成される明確な構造が安定化し（図2B）、塩基A1408とA1493は非正規塩基対を形成する（12, 39）。 塩基対の相互作用を持たないヌクレオチドA1492はRNA構造にキンクを作り、A1492とA1408 – A1493塩基対の複合効果により、Aサイトにバルジを作り、そこにパロモイシンが結合してキンクの角度をさらに広げる（Fig.2B）。 A1492とA1408 – A1493の塩基対によってできたポケットは、パロモマイシンのリングIIによって占められ、このリングは塩基G1491（図2Bの黄色の矢印で示す）の上に積み重なる(12)。 パロモマイシンのリングIは、rRNA中の「普遍的に」保存された塩基対U1406 – U1495およびC1407 – G1494と特異的に接触している。 このリングIは、アミノグリコシド系抗生物質がrRNAに特異的に結合するために絶対的に必要であることは特筆される。 パロモマイシンのリングIIIおよびIVは、これらの相互作用をさらにrRNAの主溝に拡張する。 アミノ基とヒドロキシル基は、パロモマイシンとrRNAの非特異的相互作用にほとんど寄与しており、したがって、これらは配列依存的な相互作用ではないのである。 もう一つの重要な点は、C1409 – G1491 の塩基対がアミノグリコシドのポケットへの結合の座を提供し、この位置のミスマッチ塩基対は結合を失うことである (12). 一般に、パロモマイシンと構造的特徴を共有するアミノグリコシドは、同様にrRNAに結合する(13)。 しかし、異なるアミノグリコシド系抗生物質は、同じ結合部位に2つ以上のコンフォメーションで結合するようである(28)。 要するに、RNAに結合するアミノグリコシドのコンフォメーションは、結合部位の電子的および立体的制約を満たさなければならないのである。 ゲンタマイシンClaとAサイトRNA鋳型の複合体に関する別の研究では、ゲンタマイシンClaのリングIおよびII（パロモマイシンと類似）は、パロモマイシンとAサイトRNA鋳型の複合体と同様の結合相互作用を示した (57)． しかし、ゲンタマイシンClaのリングIIIは、上部のステム領域の塩基対U1406 – U1495およびG1405 – C1496と相互作用する（Fig. 3A）。 これらの観察から、Puglisiら（57）は、16S rRNAのAサイトを標的とするすべてのアミノグリコシドは、パロモマイシンやゲンタマイシンのリングIおよびIIと同様に、共通の方法で結合すると提唱した。

rRNAの全体構造は進化的にすべての種で保存されているが、アミノグリコシドの結合は真核生物のrRNAよりも原核生物のrRNAに対して少なくとも10倍高い親和性で特異的になる違いがある（19, 35, 38）。 この結合親和性の差はそれほど大きくはなく、これらの抗生物質が哺乳類の系で毒性を発揮する理由の一端を担っていると思われる。 真核生物のrRNAはA1408の代わりにグアニンを含んでおり、G1408-A1493の塩基対を形成している。 また、C1409-G1491の塩基対は真核生物には存在しない。 これらの違いにより、真核生物のrRNAに対するアミノグリコシドの親和性は低くなっている(12, 19, 35, 38)。 これらの違いを概観すると、原核生物のrRNAのAサイトにアミノグリコシドが結合すると、Aサイトの構造が変化し、この部位におけるmRNAとtRNAの相互作用に影響を与え、コドン-アンチコドン相互作用に異常が生じることになる。 このようなリボソームレベルでの相互作用の詳細に関する構造的情報は、現在までのところほとんどないが（下記参照）、明確かつ究極の結果は、翻訳プロセスの崩壊である

別の構造研究は、トブラマイシン（図1）とRNAアプタマー（23）の結合について行われた。 この研究で用いられたRNAアプタマーは26ヌクレオチドのステムループRNAであった（図3B）。 このRNAアプタマーには、U7 – G20、G8 – U19、G9 – A18、U11 – U16という4つのミスマッチ対があり、ジッパー付きヘアピンループの一部を構成している。 トブラマイシンは、深い溝の表面と残基G15のグアニン塩基に部分的に包まれて、この溝に結合する（図4）。 この複合体では、トブラマイシンの環Iが深い溝の底に位置している。 トブラマイシンの環II上のアミノ基の一方は、深溝のリン酸骨格と相互作用し、もう一方のアミノ基は溶媒に露出している。 リングIIIは深溝の中央に位置し、水酸基は溝の底の方に向いている。 以上のようなRNAアプタマーのコンフォメーションは、tRNAやrRNAのヘアピンループと類似していることが示唆された（23）

上記の議論を整理するのに役立つのが、T. thermophilus 70S rRNAのtRNAとmRNAを含む機能複合体の7.5Å分解能のX線構造である(5)。 この構造から、トブラマイシン-RNAアプタマーやパロモマイシンを用いたAサイト-RNA（上述）のような小さなRNAテンプレートを用いたモデル研究が、rRNAの完全構造にどの程度適合するのかを想像することができるだろう。 70S rRNAの16S rRNAサブユニットにおけるAサイトは、tRNAと50S rRNAサブユニットの界面付近、コドン-アンチコドン対の近傍に見られる（図2A）。 AサイトのRNA鋳型の溶液構造と70S rRNAのX線構造のAサイトを比較すると、X線構造はパロモマイシン結合RNA鋳型と密接に関連しているように見えたが、AサイトRNA鋳型のネイティブ溶液構造とは異なっていた(5)。 これは興味深いことで、おそらく機能的な形では、塩基A1492とA1493付近の膨らみやねじれが常に70S rRNAに存在することを示唆している。 もしこれが本当なら、70S rRNAが機能するようになったとき、パロモマイシンに対する結合ポケットがすでに存在していることを意味する。 このことは、パロモマイシンが結合すると結合部位のキンク角が大きくなるという主張と矛盾する。 この考えを支持する証拠として、AサイトRNA鋳型に対するアミノグリコシドの親和力がそれぞれ異なり、in vitroでのタンパク質合成を阻害するこれらの抗生物質の能力も異なることを示唆した最近の研究がある(15)。 ゲンタマイシンをはじめとするいくつかの関連抗生物質は、マイクロモル領域の解離定数（Kd）でAサイトRNAと相互作用するが、in vitroの翻訳過程を阻害し、50％阻害濃度はナノモル領域であった(15)。 後者の結果は、アミノグリコシドがデコーディング領域（Aサイト）の無傷のrRNAに結合した結果と推察され、無傷のrRNAへの結合とAサイトの鋳型RNAへの結合の違いは、前述のようにこれら二つのRNAのコンフォメーションの違いに起因すると思われる（6074）

AサイトはmRNAとtRNAに弱い接触をすることから、自由エネルギーの微妙な変化によってこの領域が適切なtRNAを認識する役割を果たしていることが推測できる（5）。 この部位の近くにアミノグリコシドが結合すると、コドンとアンチコドンの微妙な相互作用の過程に影響を与える可能性がある。 また、アミノグリコシドの存在は、AサイトのmRNAとtRNAの複合体を安定化させ、その結果、翻訳過程に影響を与えるという説もある(5)。 アミノグリコシドがrRNAの構造に及ぼす影響のすべてを推測することは困難であり、70S rRNAなどの複合体にアミノグリコシドを結合させた構造研究がさらに進めば、アミノグリコシドの抗生物質作用につながる微妙な変化を解明し理解するのに役立つであろう。

多くの研究が、RNAテンプレートとアミノグリコシドの間の相互作用を理解するために合成プローブを使って行われている。 アミノグリコシドはリボザイムにおいて複数の標的部位に結合することが示唆されている(6, 30)。 最近、ネオマイシンB、トブラマイシン、カナマイシンAなどのアミノグリコシド系抗生物質が “テザー “を用いて対称または非対称に二量化され、その結合親和性が単量体の親アミノグリコシドと比較された(30)。 RNA上に複数の結合部位があれば、二量体化したアミノグリコシドは親抗生物質よりも高い親和性で結合するはずであることが示唆された。 実際、二量体化したアミノグリコシドはテトラヒメナのリボザイムに親アミノグリコシドの20倍から1200倍もよく結合することが観察された。 二量体化したアミノグリコシドは正電荷を持つアミノ基の数が増えたことが、高い結合親和性の理由の一つと考えられるが、この効果は二量体化によって得られるエントロピー的な利点と相乗的であるようだ (30) 。 また、RNA分子中にアミノグリコシド系抗生物質に対する高親和性結合部位が複数存在することも示された。 別の研究では、パロモマイシンのRNA結合特性と、ピレンやチアゾールオレンジなどのある種の化合物のインターカレーション挙動を利用することが試みられた(48)。 この戦略では、アミノグリコシドをRNAへのインターカレーション剤の供給手段として想定している。 パロモマイシンとチアゾールオレンジまたはピレンのコンジュゲートは、27ヌクレオチドのAサイトRNAテンプレートに優れた結合特性を示した。 実際、パロモマイシン-チアゾールオレンジ結合体の解離定数は46 nMと測定され、これはrRNAのAサイトがいかなるリガンドに対しても示した最高の親和性と報告された。

アミノグリコシドによるRNA結合の構造要件から、アミノグリコシドの結合にはRNA配列中のバルジが必要であることが示された（7）。 RNAアプタマーの特定のステムループ誘導体を用いて、一連の化学干渉、化学修飾、突然変異の研究を行い、トブラマイシンのRNAアプタマーへの結合に必要な構造的条件を理解した。 このアミノグリコシドは、主にRNAアプタマーの核酸塩基と相互作用し、リン酸塩基とは相互作用しないようであった。 しかし、化学量論的な比率でトブラマイシンが高親和性で結合するためにはバルジの存在が重要であると提唱され、バルジがアミノグリコシドと核酸塩基の相互作用のためのキャビティを作り出すと結論付けられた（7）。 この類推は、ハンマーヘッド領域やAサイトなどの他のRNA部位にも適用でき、非正規の塩基対やループ、バルジによって空洞が存在し、アミノグリコシドがアニオン性のリン酸基や核酸塩基と相互作用するために適した部位を作り出しているのである。 Westhoffら（49）は、アミノグリコシドとRNAの相互作用は配列特異的ではなく、形状特異的である可能性が高いという提案を行った。 HermannとWesthoff（20）は、トブラマイシン-RNAアプタマーや16S RNAのAサイト領域など、構造情報が得られる様々なRNAテンプレートにおいて、いくつかのアミノグリコシド系抗生物質のドッキング確認が行えた。 これらの観察に基づいて、HIVのトランス活性化応答要素領域に対するアミノグリコシドの結合様式が予測された(20)。 Revタンパク質の結合領域であるHIVのRREに関する別の研究として、ChoとRando（8）は、アミノ配糖体の結合に一塩基のバルジとキャビティがどのような役割を果たすかを調べた。 これまでの仮説と一致して、RNAの非二重鎖領域の溝がアミノグリコシドのRNAへの高親和性結合に重要であることが推論された。 この場合、一塩基のバルジは結合に影響を及ぼさなかったが、2つの非正規塩基対と1つの一塩基バルジUからなるGリッチ領域であるキャビティは、アミノ配糖体に対して高い親和性を有している。 この空洞をいじるとRRE RNAのアミノグリコシドに対する親和性が低下することから、非正規塩基対を含むバルジがこのRNA鋳型の主要なアミノグリコシド結合部位であることがわかった（8）＜6074＞。