APAとASを比較。 a-c APAのパターンが大きく2種類に分類できる。 UTR-APAとCR-APAである。 UTR-APAの場合、alternative PASは3′-UTRに存在する。 したがって、UTR-APAは、コーディング配列を変えることなく、UTRの長さが変化する転写産物を生成することができる。 CR-APAには大きく分けて、コーディング配列が切断された転写産物が得られる可能性があります。 d 黄色は拡張エキソンのラベルに使用されます。 ASの場合、e-constitutive splicing；fエクソンスキップ／インクルージョン；gオルタナティブ5′-スプライスサイト；hオルタナティブ3′-スプライスサイト；iイントロン保持；j相互排他的エクソン

プレmRNA 3´-プロセシング複合体は、正規ポリ（A）シグナル配列AAUAAAまたはその近縁変異（ex.AAAUAA, AUAAAA, AUUAAA, AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUAA, AUAAAC, AAAAUA, AAAAA, AAAAAG）などがあり、ゲノム全体で様々な頻度で利用されている。 UGUAエレメントはpAサイトの上流に、U-richエレメントはpAサイトの近くに、U/GU-richエレメントはpAサイトの下流100 nts以内に存在することが多く、UGUAエレメントはpAサイトの上流に存在することが多い。 しかし、ヒトのポリ（A）シグナルの約20％はU-/GU-rich領域に囲まれていない。

哺乳類細胞の80のコアファクターのうち、約20がC/P機構に関与している。 一般に、これらのコアファクターは以下の4つの要素に分けられる（図2）：

APA複合体とその機械。 CFIm複合体は保存された上流のUGUA領域に結合して切断反応を媒介し、CPSFやCSTFを含む他のタンパク質をリクルートする。 PAPと結合した後、この複合体はプレmRNAの中を5′から3′の様式で移動する。 AAUAAA領域に到達すると、アデノシン酸性化シグナルであるCPSFがポリアデニル化シグナルAAUAAAを認識し、CPSF73がmRNAを切断する。 その後、CSTFはGU-またはU-rich配列に結合する。 CPSFのFIP1L1サブユニットに結合したU-rich領域は、ポリアデニレーションシグナルAAUAAAと切断部位の間に位置する。 シンプレキンは足場タンパク質として機能し、PAPは未鋳型のアデノシンの付加を触媒する。 一般に、近位のPAを使用すると短いアイソフォームが生成され、翻訳が抑制されるため、タンパク質量が少なくなることが多い

CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) はCPSF1〜CPSF4（CPSF160、CPSF100、CPSF73、CPSF30）、WDR33およびFIP1L1（Fip1）より成るが、CPSFは、CPSF160とFIP1L1より成るが、CPSF4は、CPSF160とCPSF100より成るが、FIP1L1は、CPSF130より成る。 現在のところ、WDR33とCPSF4が直接pAsと相互作用し、CPSF3が核内切断を行うことが分かっている。 CPSFは複合体として働き、ポリアデニレーションシグナル配列AAUAAAを認識し、プレmRNAを切断する。 これは、pA部位の選択、遺伝子発現、癌細胞の移動、転移、そして最終的には病気の転帰を制御する上で重要な役割を果たすと思われる配列特異性を提供する。 CPSF複合体の一部であるCPSF73は、pA部位でプレmRNAを切断するエンドヌクレアーゼである。 しかし、酸化ストレス下では、CPSF73は核から細胞質へと移動し、前立腺癌におけるポリアデニレーション活性を著しく阻害する。 さらに、CPSF複合体のメンバーであるFip1は、細胞の自己再生の制御因子として機能する可能性がある。 実際、マウス胚性幹細胞（ESCs）においてFip1を欠損させると、遠位ポリ（A）部位（dpA）が優先的に使用されるため、細胞の未分化状態や自己複製能力が失われ、最終的に細胞の運命を決定する選択された遺伝子の3′-UTRが伸長されることになる …

CSTF（切断刺激因子）は、CSTF1、CSTF2、CSTF3（それぞれ50kDa、64kDa、77kDa）からなり、切断反応に重要な役割を担っている． CSTF複合体は、切断部位の下流にあるU-またはGU-リッチフィールドに結合し、切断を促進することができる。 例えば、CSTF2はCSTF64としても知られ、U/GU-rich領域と直接相互作用して3-末端の処理効率を調節している . CSTFはpAsの利用を促進するだけでなく、細胞増殖に影響を与え、癌の浸潤や予後のバイオマーカーとして機能する可能性があることを報告する研究もある . CSTF64は、複数の腫瘍型において、必須のポリアデニル化因子として、また3′-UTR短縮のマスターレギュレーターとして働いていることが知られています。 CSTF64の発現は肺癌の予後不良と関連し、CSTF64の過剰発現は肺癌細胞の増殖と浸潤を促進することがわかった。

CFI と CFII (cleavage factors I and II) は、CFIm25 (NUDT21/nudix hydrolase 21/CPSF5), CFIm59 と CFIm68 からなり、これらは保存されたUGUAモチーフの上流で切断反応に関与している … 続きを読む CFImの結合は、pA領域全体をループ化し、それによってAPA部位の選択を誘導することによって、pA部位の主要な決定因子として機能することができる。 シンプレキン、ポリ（A）ポリメラーゼ（PAP）、ポリ（A）結合タンパク質（PAB）など、他のタンパク質も同様にAPA部位の選択を制御することができる。 PAB（PABII、RBBP6、PABPN1）は成長するポリ（A）テールに結合し、CPSFとポリ（A）ポリメラーゼの相互作用を阻止する。 これらの活性は主にテールが250 ntsになったときに起こり、APAの進行中にポリ(A)テールの長さを制御することが目的である

APAの制御には通常、C/P機構に関わる因子が関与している。 その中でもCFIm25はAPAの主要なグローバルレギュレーターとして同定され、そのノックダウンにより近位ポリ（A）シグナルの使用へのグローバルスイッチだけでなく、標的遺伝子の安定性と発現を向上させる。 Huangらは、CFIm25のノックダウンにより、CCND1とGSK3βの転写レベルが著しく上昇し、さらに、いくつかの癌遺伝子（IGF1R、CCND1、GSK3β）によるdPASの利用を減少させることを報告した。 さらに、遺伝子オントロジー解析（GO）により、CFIm25はMAPKシグナル経路を介してAPAを調節するだけでなく、癌関連シグナル経路やタンパク質ユビキチン化シグナル経路にも関連することが示された。 さらに、CFIm59ではなく、CFIm25とCFIm68を枯渇させると、HEK293細胞において近位ポリアデニル化部位が選択されるようになることがわかった . しかし、Xia らは、腫瘍組織と健常組織の間には CFIm25 の発現の違いはないと報告している . また、Kubo らは、CFIm はポリ（A）部位の選択には関与していない可能性があると報告している。 さらに、高垣らは、CSTF64がAPA 3′末端処理の最初の因子であること、IgMがAPAを用いてマウスB細胞を活性化することを示した . CFImはAPAの制御において重要な役割を果たしていると思われるが、その正確な役割はまだ不明である。

RBPは、ポリアデニル化装置タンパク質と競合したり、その標的部位への結合を強化することによって、APAのmRNAを標的とする能力に影響を与える可能性もある。 Xiangらは、異なる癌種の大規模データベースからグローバルなAPAプロファイルを解析し、PABPN1が異なる癌種におけるAPAプロファイルのマスターレギュレーターであることを示唆した。 CTRP データセットでは、PABPN1 の発現が 31 種類の薬剤に対する感受性と統計的に相関していることが示された。 RBPは単独で働き、他のAPA因子が近位のポリ（A）部位に結合するのを阻害したり、RNAの安定性を維持する役割を通じてAPAの選択に影響を与えることができる。 さらに、RBPは動的なAPAプロファイルを制御し、有糸分裂から有糸分裂への移行を促進することができる。

How APA is regulated

APA is a very comprehensive molecular biological process, involving numerous cellular elements.RBPは、APAを制御するために必要な分子機構である。 現在、このユニークな生物学的プロセスについて、我々はまだ多くを知らない。 しかし、細胞生物学におけるAPAの重要性と新規のがん治療標的としての可能性が科学界に認識されて以来、この状況は短期間のうちに急速に改善されました。 APAは、多数のコアファクターがダイナミックに、かつ時空間的に協調するプロセスである。 例えば、CFImはプレmRNA中の特定のRNA配列に結合し、CPSFのサブユニットであるhFipとの相互作用を通じてコア因子CPSFをリクルートする15 。 CSTF-64はCPSF73と相互作用するが、CFIm25とは相互作用しない可能性がある。 健常組織に移動した細胞では、CSTF64とCPSF73の両方のレベルが上昇していることが観察されたが、CFIm25のレベルについては観察されなかった。 CFImは、それ自身または他のコアファクターのレベル、および潜在的な切断部位の周囲のRNA配列に応じて、切断とポリ（A）付加を交互に刺激または抑制することによって、プレmRNA 3′-プロセシング複合体の組み立ての初期段階に関与する。

コアファクターの他に、局所的なクロマチン構造、ヌクレオソーム位置、DNAメチル化、ヒストン修飾などの様々な生理条件もAPA制御に関与する。 興味深いことに、5′-末端のキャッピングに関与するいくつかの因子も、切断とポリアデニレーションの両方の効率に影響を与えることができる。

さらに、APAは転写レベルでも制御することができる。 転写の開始、進行、スプライシングなどの転写機構は、ポリアデニレーションの効率と特異性に影響を与えると思われる。 したがって、プロモーター領域の特定の配列要素とポリ（A）サイト選択との関連を調べることは、この興味深い現象の背後にあるメカニズムの解明に大いに役立ち、新しい癌治療戦略の開発につながる可能性があります。

APAの解析方法

1980年にIgMとジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子コード化におけるpAの効果が観察されて以来、APAを特定し研究するための一連の厳しい研究方法と戦略、例えば次世代シーケンサー（NGS）技術「ポリA-ClickSeq」が開発されてきました … これらの新しい方法論のサポートにより、特にNGS技術の進歩とそれらの遺伝子発現バリアントからのシーケンスデータの急速な蓄積により、実験的に決定された遺伝的pAデータベースは継続的に拡大しています。

3′-enriched RNA-seq プロトコルに基づき、APA解析方法は主にオリゴ（dT）プライミングベース方法とRNA操作ベースの方法という二つのカテゴリに分類することができる。 APAの発見には、mRNAの3-末端にマッピングされたリードのみが有用であるため、これらの手法ではリードの数が制限される。 もし、5末端や3末端へのリードのカバレッジが低ければ、RNA-seqはpAを正確かつ広範囲に同定するのには適さないだろう。 さらに、アイソフォーム転写物のオーバーラップによるリードマッピングの曖昧さを解消することも課題である。 RNA-seq には読み取り長の制限がありますが、3′-UTR 長の相対的変化を定量化し、APA イベントを予測するための様々な RNA-seq アルゴリズムが開発されています。 また、Dynamic Analyses of Alternative PolyA Adenylation (DaPars), 3USS, MISO, Roar, QAPA, Change Points など、いくつかのpA検出およびAPA解析手法とアルゴリズムがここ数年で開発されている。 2019年のGruber and Zavolaneloquentlyによるレビューでは、これらの手法を比較しています。

DaPars はこれらの中で最も人気のあるデータ解析手法ですが、QAPA はより効率的で感度の高い手法です . DaParsは、RNA-seqデータに基づいて遠位pAを特定し、回帰モデルを用いて、事前のAPAアノテーションに関係なく、2つの条件間の動的APAイベントのde novo特定と定量化を行う。 シーケンシングリードが得られる確率は、個々のアイソフォームで統一されています。 pA は、RNA-seq リードカバレッジの明確な低下を示す遺伝子位置に沿った位置に存在します。 遺伝子に沿ったRNA-seqの不均一性バイアスを補正した後、近接したAPA部位の正確な位置を特定し、統計的に有意な動的APAとその活性を検出することができる。 DaParsの主要な方法論的革新は、追加の実験に頼ることなく、既存のRNA-seqデータからde novo APA事象を直接推論することである。 DaParsのもう一つの利点は、カットオフを増やすことで偽陽性の結果を与える可能性のある隣接する遺伝子の重複を解決できることである。

QAPA は、alternative 3′-UTR アイソフォームの絶対発現量を直接推定することにより、従来の RNA-seq データから APA を定量的に推論するものである。 そして、全アイソフォームの中での各アイソフォームの相対発現を計算し、APAを評価する。 QAPAの限界は、あらかじめ定義されたpAを必要とすることである。 しかし、この問題は、3′-UTR RNA-seq や他のリソースからのデータを組み込んだ注釈付き pA の拡張リソースを生成することによって軽減することができる。 転写産物の3′-末端におけるリーディングカバレッジバイアス、非鋳型ポリ（A）テールを含むリードの低い収率、および重複する転写産物アイソフォームにおけるリードマッピングのあいまいさのために、pAを正確にマッピングしようとすると、正規のRNA-seqデータに基づく方法は制限されています。 しかし、分子技術の進歩に伴い、APAを研究するための方法は継続的に増加している。 WangらはCRISPR/Cas9の手法を用い、弱いポリ（A）シグナルを正規のポリ（A）シグナルに編集し、シグナルを特定のポリ（A）部位に向けることによって、APAの生物学的機能を研究している。 canonical RNA-seqデータに基づく解析戦略は、APA研究コミュニティで最も利用されている。

シングルセルレベルの研究 シングルセルアプローチの利点は、様々な組織や分化に由来する細胞から抽出したRNA材料の混合物を含むバルク細胞のバックグラウンドノイズを大幅に削減できることである。 これまでシングルセルのAPA研究はほとんど行われていませんでしたが、この技術はシングルセルRNA-seq（scRNA-seq）の高深度かつ全長であるため、APAを正確に解析することができるツールとなっています。 Jingle BellsやscRNA-SeqDB（https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/）は、scRNA-seqデータセットを利用して、様々な種類の癌を調査している。 Yeらは、健常対照者とAML患者の両方を含む大規模なサンプルコレクションから、異なる骨髄単核細胞タイプにおける動的なAPA使用量の変動を調査するためにscRNA-seqデータを使用することを報告しました。 彼らは、健常者と比較して、AML患者は8つの異なる細胞型においてAPAの多様性が低いことを発見した。 さらに、APAの制御が白血病進行中の赤血球造血に広く関与していることを、単一細胞レベルで明らかにした。 Kimらは、11人の乳がん患者から抽出した515のscRNA-seqデータセットを解析し、遺伝子発現レベルやAPAパターンと組み合わせて、3′-UTR長の変動から細胞型特異的APAを単一細胞レベルで同定できることを報告しました。 さらに、乳がんにおける免疫特異的なAPAシグネチャーは、早期乳がんの予後マーカーとして活用できる可能性があることを示した.

APA and alternative splicing: APAとalternative splicing（AS）の間には大きな違いがあるが、APAもASも様々なアイソフォームを生成し、プレmRNAの過程で互いに相互作用することさえある。 さらに、APAには4つの典型的なアイソフォームがあるのに対し、ASには6つのアイソフォームがある（図2）。 様々なヒトの組織や細胞株から得られたトランスクリプトームデータのいくつかの詳細な解析により、APAとASの間に強い相関関係があることが明らかになった。 pAが末端エクソン内にある場合、APAはCR-APAと名付けられた特別なタイプのASのように振る舞うことができる。CR-APAはフレーム内の停止コドンや3′-UTRを持つことができず、非停止コードを介したmRNA崩壊プロセスによって急速に分解されると考えられる（図1b） 。 Shenらは、APAとスプライシング因子SRSF3が一緒になって、細胞の老化プロセスを調節していることを報告した 。 APAはスプライシング因子が介在するASの一部で役割を果たすかもしれないが、スプライシング因子もまたAPA要素と協力してこのプロセスを支援する可能性がある。 例えば、U2AF2とRBPは、ポリピリミジントラクト付近の3′-末端形成を促進するために、CFIと相互作用してリクルートすることが可能である 。 さらに、CPSF複合体はスプライシング因子TFIID（転写因子II D）と相互作用し、RNAポリメラーゼIIを制御することができる。 また、U1 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) がイントロン内で働き、早期の切断やポリアデニレーションを抑制することが観察されています。 U1の枯渇はイントロンのポリ（A）シグナルの活性化をもたらし、ゲノムワイドなAPAを引き起こす。 例えば、スプライシング因子3Bサブユニット1（U2 snRNPの構成要素で、SF3b1とも呼ばれる）のアブレーションは、イントロンPASを活性化させることができる。 U1 snRNPはまた、独立してAPAスプライシング活性に影響を与えることができる。 U1 snRNPは転写産物の5′-末端領域に結合し、潜在的な切断因子の認識をブロックすることができるので、U1 snRNPのノックダウンはその転写産物領域に近いイントロン内のpA部位の利用を増加させる … しかし、Movassatらは、APAとASの関連は末端イントロンに限定されることを示した。 また、彼らはCstF64のノックダウンが間接的にHeLa細胞のAPAではなくhnRNP A2/B1のASに影響を与えることを示した。

How APA regulate cell cycle

TP53, CDC6 (cell division cycle 6), CyclinD1 (CCND1) and CDK (cyclin-dependent kinase) など多くの遺伝子には細胞周期チェックポイントと関連するものが存在する、細胞周期進行を制御する。 プレmRNAは通常複数のpA部位を持つため、細胞周期に関連する遺伝子産物はAPA機構により調節され、様々なアイソマーを生成する。 DNA複製の主要な制御因子であるCDC6の3′-UTR短縮は、乳癌細胞におけるCDC6タンパク質レベルの上昇およびS期進入の増加と関連している 。 サイクリンD1は、多くの細胞種でG1-S期移行を促進する重要な役割を担っているが、UTR-APAとCR-APAの両方のメカニズムでAPA制御を受けている . また、Xiang らは、APA イベントと関連する全 20,532 遺伝子の上位 10％を調べ、これらの遺伝子の多くがクロマチン構造関連活性に関与していることを観察し、APA 処理とクロマチン構造修飾の関係を示唆した . Mitraらは、マウスの皮膚切除創を解析することにより、APAが細胞周期と組織移動の間のリンクとして働くことを発見した 。 彼らは、創傷に隣接する増殖細胞は、創傷のない皮膚の静止線維芽細胞よりも高いレベルのAPA因子を発現していることを明らかにした。 PIGNは紡錘体集合チェックポイント蛋白と相互作用して細胞周期を制御しているが、その3′-UTRには6つのpA部位が存在することがわかった（図3）