結果と考察

KSIの様々な変異モデル系の構造とエネルギーは、三つの反応ステップに沿って研究されている。 1つ目はC4-βプロトンの脱離(ES → TS1 → EI1)、2つ目はプロトン化したAsp-40のわずかな回転(EI1 → TS2 → EI2)、3つ目はAsp-40によるC6-β位へのプロトン供与 (EI2 → TS3 → EP) である（図1参照）。 1. WTの予測されるエネルギープロファイル（図2A）は、Pollackと共同研究者の対応する実験的なものと似ている（25）。 TS2では、触媒残基のH原子が基質中のオキシアニオン（O3）に接近し、余剰電子がH結合経路を通じて基質から隣接する触媒残基に移動するため、基質が部分的に中和されることに注目する必要がある。 このように、基質、Tyr-16/57、Asp-103は1つの負電荷ユニットを共有し、それらの電荷分布は変異体の触媒残基のプロトン親和力と電子親和力に依存する。 この触媒残基のあるTS2状態は、触媒残基がない場合、基質がほぼ1単位だけ負に帯電している状態と対照的である。

我々が計算したEIの三次元構造（ステロイドではなくエクイレニンとの複合体）はPI（g）とTI（g）のX線構造とほぼ完全に一致した． Tyr-16/57 + Asp-103 + Equilenin 複合体の予測構造では、Tyr-16 と Asp-103 の二つの距離の d(O3-Or) 値（それぞれ 2.54 と 2.55 Å）はX線データ（PI の場合は両方とも 2.6 ± 0.1 Å、TI の場合はそれぞれ 2.58 ± 0.08 Åと 2.62 ± 0.07 Å）とよく一致している (32, 33, 36)。 計算された構造は無制限に最適化されているため、実験と理論の形状が一致していることから、酵素では主要な残基が基質とほぼ最大限の相互作用を無理なく行っていると考えられる。

溶液中のTI活性部位は、TIやPIのX線構造とは異なる二元構造（Asp-99 … Tyr-14.. Equilenin） (29) であろうと推測されている (32, 33) 。 しかし、最近のPI/equileninのNMR実験では、Mildvan (29) やPollack (25) のグループによるTI/equileninの場合と同様に、PI(D40N)/equileninでは16.8 ppmに特有の強い下界共鳴が、13.1 ppmに弱い共鳴が現れることが示されている (36) 。 この結果は、Tyr-16/57 + Asp-103 + Equilenin 複合体の第一原理計算でも示され、16.5ppmの強い下磁場共鳴はTyr-16に割り当てられていることがわかった。 また、変異体D103L + D40Nでは、強い下方共鳴（Tyr-16に割り当てられる）が現れるが、変異体Y16F + D40Nでは強い共鳴が消失することが示された。 このことから，Tyr-16とH結合しているAsp-103に強いdown-field共鳴があるという二重構造は，この実験から明らかに除外された(36)。

絶対速度定数は，活性化障壁の計算値を使って調べることができる。 B3LYP/6-31+G*およびMP2/6-31+G*レベルでは、KSIのWTの活性化障壁は、Pollackらが報告した実験障壁（10〜≒11 kcal/mol）と比較して、やや過小評価されている(46)。 しかし、KSI の誘電体媒体効果 (31) を考慮すると、WT の活性化障壁は 8.2 kcal/mol であり、実験値とほぼ一致する。 2-3kcal/molのわずかな過小評価は、より正確な計算と、活性部位周辺の無極性残基を含むより完全なモデル系で説明できるだろう。 絶対活性化障壁とは対照的に、異なる変異体間の相対活性化障壁、ひいては反応機構は、類似の環境を持つ異なるモデル系間のキャンセル効果により、計算レベルに関係なく非常に一貫している。 このように、異なる変異体間の相対的活性化障壁を用いることで、ESからTS1への移動が反応経路の律速段階であると仮定した相対反応性（変異体の速度定数とWTのそれの比）またはlog（kcat/kcat（WT））を得た（表1の脚注を参照）。 MP2計算により、B3LYPレベルで得られた結果が補強された。 log(kcat/kcat(WT))の予測値は、PI (32-35) とTI (25-28, 31) の測定値とよく一致した(Table 1)。 TIの相同性の高い3次元（3次、4次）構造と活性部位環境がPIと類似していることから、2つのKSIの触媒反応は同じように進行すると予想される。

a-gの7モデル系における活性化エネルギー（ΔETS1）、相対反応速度、NMR化学シフト（ΔEI1）計算値Fig. 2は、反応経路に沿った様々な変異体のエネルギーとH-結合距離のプロファイルを示したものである。 全体のエネルギープロファイル(ΔE) (Fig. 2A)はTS2に関してほぼ対称的である。 第一ステップと第三ステップの障壁は似ている。 第2段階は障壁が小さく（≒1 kcal/mol）、C-C結合（図1および図3ではC-H結合）に対して最小限の回転（Asp-40は基板面に対して大きく傾斜しているのでわずか数度）を通じてH原子がわずかにシフトするだけなので速度決定にはなり得ない。 したがって、この反応は実質的に2段階のメカニズムであると考えることができる。 残基は、第1段階では基質にプロトンを（部分的に）供与することによって触媒し（酸として）、第3段階では基質からプロトンを（部分的に）受容することによって触媒する（塩基として）。 H結合の酸素間距離、O3とOrの中点からの共有プロトンのオフセンター距離を参照し、正負の値はプロトンが残基/基質の近くにあることを示す。

プロトン親和力（気相ではpA、誘電体ではpKa）が低い酸性残基では、活性化障壁は第1段階で低く、第3段階で高くなるが、pAまたはpKaが高い塩基性残基は逆の効果がある。 その結果、2段階の酵素機構では、酵素の残基が反応全体に対して、基質への/からの非常に強いプロトン供与体/受容体の二重の役割を果たすとき、最適な触媒力が得られる（アミノ酸/塩基触媒またはプロトン/電子バッファと名づけられる）。 酵素の誘電体媒体中では、残基と基質のpKaが等しい場合に最大の触媒効果が得られる。 この状況は、pKaの大きな差が反応性を高める一段階反応とは対照的である(47, 48)。 触媒効果を最大にするために残基と基質のpKaが等しいという条件は、最大のSSHBを形成するために酵素中の残基が基質と同等のpKaを持っているという条件と一致している (4-7, 15, 23, 24)。 したがって、KSIの2段階の反応機構において、部分的なプロトンシャトルと電荷再分配とともに、アミノ酸/塩基触媒としてのSSHBは、残基駆動型の安定化エネルギーと反応経路に依存したES状態に対する酸素間距離短縮で、約15 kcal/molの強安定化に決定的役割を演じている 。

残基駆動型安定化エネルギーΔΔEaは、プロトン移動が残基から基質に起こらない限り、ΔdESにある程度相関する（すなわち, 図2CでΔrHが負領域にない限り）。 したがって、EIやTSでの安定化は、ES状態に対するH-bond距離の短縮、ひいてはH-bond強度の向上と相関することができる。 つまり、ESでは（中性同士の）通常のH結合が、EIやTS2では（イオン種が関与する）SSHBになる傾向がある。 したがって、これらの短い結合が残基駆動型エネルギー低下の一部を担っているはずである。 プロトン移動に関しては、ESでのポテンシャルは全ての変異体で1重井戸であるが、ΔrHがゼロに近い領域（すなわち、図2CのcのTS1/EI1、eとfのEI1/TS2付近）の（EIやTS付近の）ポテンシャル形状は2重井戸の特徴を有している。 ΔrHの絶対値が小さい場合（＜4225＞≒0.5Å）（図2C）、我々の計算ではプロトン移動の障壁は非常に小さいことが分かっており、ダブルウェル型ポテンシャルでのプロトン移動だけでは活性化障壁の大幅な低下を説明できない。 実際、プロトン移動が少なくポテンシャルのダブルウェル的な性質がほとんど消失しているケースgは、ダブルウェル的なポテンシャルでプロトン移動を伴うケースfよりもエネルギー低下が大きいことが分かります。 一方、図2のDとEで注目すべきは、プロトン移動が起こった後、ΔdESはもはや短くならず、わずかに長くなるが、ΔEaは依然として低くなることである。 したがって、H-結合長の短縮（すなわち、ΔdES）だけでは、TSとEIでの急激な障壁の低下（すなわち、ΔΔEa）を説明することができない。 したがって、TSとEIにおける障壁の低下は、基質と残基間の分子軌道（MO）相互作用（電荷移動による電子再配列または電荷再分配を含む）の観点から議論する、追加の相互作用力によって説明する必要がある。

fとgのように競合する二つの残基の場合、EIs/TSの累積安定化はより増強したkcatとなる。 しかし、この効果は、他の残基の存在により、各残基のオキシアニオンのプロトン引き込み力が減少する結果、ややsubadditive（すなわち、各残基の安定化エネルギーの合計よりも小さい）であった。 この亜加法性は、SSHBが電荷移動と分極（すなわち、誘導された静電相互作用）、そしておそらく部分的な共有結合を含むであろうことを示唆している。 実際、触媒残基の存在下でのEIとTSの安定化は、主に活性部位に存在する過剰電子の電荷移動と分極による非局在化から生じるが、これについては以下で見ていく。 TS1のケースa、c-e、fにおける基質の有効自然結合軌道人口電荷（49）は、それぞれ-0.57、≒0.43、-0.37である。 このように、触媒残基が2つあると基質の負電荷がより減少することがわかる。 これは、余分な電子が基質から電子親和性の高い触媒残基へ移動し、余分な電子のバッファーの役割を果たすためである。 AspはTyrより強い電子吸引力を持つが、TyrはAspより電子親和力が低い。 したがって、TyrはAspと同等か、それよりもわずかに活性化障壁を低くする効果がある。 触媒残基の存在下でのTSやEIの安定化は、基質に加えて触媒残基があることで余剰電子の収容空間が拡大し、余剰電子状態のエネルギー低下と高い相関がある。

化学シフトの計算結果は、同じ数のH結合ではd(O3-Or)の最小値とある程度の相関があるが、2番目のH結合があるとスクリーニング効果が高まるため、δが増加することが分かった。 この結果から、δが大きいことはしばしばSSHBの良い指標となるが、δはkcatと一部しか相関がないことがわかった。 特にδが大きい場合（>16ppm）やΔrHの絶対値が小さい場合（<0.5Å）にはこの相関が薄れ、kcatのδ依存性が疑われている（50）。

触媒残基があると活性化障壁が下がることは、MO分析からよく理解できる（図3）。 aとgの間のTS2 MOエネルギーレベルの顕著な違いは、Asp-40による脱プロトン化によって基質上に蓄積された過剰電子密度の量子的性質に起因するものである。 その結果、電子密度の一部を触媒残基に散逸させることで得られる安定化は、先に述べた不確定性原理によるもので、過剰電子が水クラスターと相互作用する場合に見られるのと同様であり（51、52）、適度に大きなキャビティ空間が有利である。 このように、触媒残基の存在（基質から触媒残基への部分的な電子移動により電荷バッファーの役割を果たす）は、オキシアニオンへの電荷の蓄積を劇的に減少させるのである。 このEIとTSの安定化は、本質的にSSHBによって支援される。 この効果はAsp-103とTyr-16/57の両方が存在する場合、非常に大きくなる。 したがって、ケースgのMOエネルギーはケースaのそれよりもはるかに低い。酵素の誘電体媒体効果は、電子移動を伴う触媒残基効果ほど劇的なものでない。 したがって、SSHBによって促進される部分的なプロトンシャトルと電荷再分配は、酵素の誘電体効果よりも、TSとEIの低下に関与している。 その結果、触媒効果は、非誘導性静電エネルギーとMO相互作用エネルギー（分極、電荷移動、共有結合エネルギー）による利得の有利な組み合わせによってもたらされることになる。 前者は荷電した水素結合の存在による部分的なプロトンシャトルに起因し（したがってSSHBの強さに関係する）、後者は触媒残基が過剰電子のバッファーの役割を果たすため、主に電子の非局在化に起因するものである。 MO相互作用のエネルギー増加は、SSHBによって促進される追加の酵素-基質相互作用と密接に関係している。

したがって安定化エネルギーは、ESの通常のH結合（中性パートナー間）に対するEI/TSの（イオン種を含む）荷電H結合の増強エネルギーと触媒残基に電子散逸を含む電荷再分配によるMO相互作用エネルギー増加の和として表わすことができる。 この2つのエネルギー項は容易に分離できないため、それぞれの項を推定することは困難である。 しかし、ここでは、以下の方法により、ケースdのこれらの項を評価した。 Tyr-16（Y16）非存在下と存在下でのESに対するEI1のエネルギーの比較から、Y16によるEI1の安定化エネルギーは8.7 kcal/molであることがわかった。 この安定化に対する非誘導性静電相互作用（残基Y16に対する基質＋Asp-40（D40）の静電誘導効果を含まない）の寄与を調べるため、Y16をその自然結合軌道（NBO）電荷のみからなる幽霊残基（Y16q）に置換した場合のESとEI1の計算を、基質＋D40がない状態でY16一分子に対して実施した。 すると、非誘導性静電相互作用エネルギー利得（または前組織化駆動性静電エネルギー利得）は4.4 kcal/molであり、これは荷電H結合（すなわちSSHB自体）の結合強度を高める役割を担っていることがわかった。 そうすると、Y16による完全量子効果とY16qによる非誘導静電効果の安定化エネルギーの差（4.3 kcal/mol）は、誘導静電相互作用エネルギー、共有結合エネルギー等に由来するはずである。 誘導型静電相互作用には、分極効果や電荷移動効果が含まれる。 誘導される静電エネルギー利得を得るために、まず、基板＋D40の存在下での誘導効果を含むY16の原子電荷（Y16qind）を求めた。 次に、Y16をその原子点電荷のみからなるゴースト残基（Y16qind）に置き換えた場合のESとEI1の計算を行った。 この安定化エネルギーは8.2 kcal/molであるため、基板+D40とY16の相互作用による静電エネルギー増加は3.8 kcal/molである。 このように、電荷移動と分極によるエネルギー獲得は大きく、非誘導の静電的エネルギー獲得と同程度である。 Y16は、基質中の過剰な負電荷の大部分を引き出して保持する電荷バッファーの役割と、反応中の電子電荷の再分配を担う重要な触媒的役割を担っていることがわかる。 この誘導された静電エネルギーは、触媒残基（Y16）と基質＋D40間の量子力学的電子電荷相互作用によるMO相互作用エネルギー（すなわち、SSHB駆動型基質-残基相互作用エネルギー）から生じている。 最後に、0.5 (= 8.7 – 8.2) kcal/molの残りのエネルギーは、ほとんどが非静電的共有結合エネルギーに対応するものと思われる。 このエネルギーはかなり小さく、さらにSSHB自体の非静電的な軌道の重なりが大きくないという我々のMO解析によって裏付けられた。

2段階の反応機構を含む酵素では、基質は完全に負に帯電するのではなく、触媒残基への電子散逸によって一部がアニオンになる。 この場合、通常のH結合に対するSSHBによる安定化エネルギー増分(EI1において≈10 kcal/mol)は小さくはないことがわかった。 もし、SSHBエネルギーを基質と残基の電荷再配分による基質-残基相互作用にまで拡張すると、前組織化駆動のSSHBエネルギーとSSHB駆動のMO相互作用エネルギーの和が安定化エネルギーとなる。 しかし、SSHBそのものの強さだけを考えると、結合エネルギーの増分はかなり減少する（≒5 kcal/molになる）

。