重要なトピック。

遺伝子治療の一般的なプロセス

関連記事。 プラスミドとは何ですか。

プラスミドの調製。

実験に適したプラスミドを選択する。

プラスミドには、複製起点、プロモーター領域、抗生物質耐性遺伝子など重要な配列が含まれている必要があります。 制限酵素法を用いてプラスミドに挿入部位を導入し、そこに目的の遺伝子をライゲーションします。

パワーシーラーのようなT4DNAリガーゼを用いて、目的のDNAをプラスミドに挿入・ライゲーションします。 また、プラスミドと一緒に選択マーカーも導入し、組換えDNAの同定を行います。

さらに、目的の遺伝子を効率よく発現させるために、プロモーター領域やターミネーター配列もプラスミドに含ませています。 このように、目的の遺伝子とその他の重要な配列を持つプラスミドを、現在では組換えDNA分子と呼んでいます。

これで組換えDNAの発現の準備が整いました。

遺伝子クローニングを行う場合、プラスミドを細菌の宿主に挿入しますが、一般的には大腸菌が使われます。 菌が分裂を始めると、組換えプラスミドDNAも一緒に複製されます。

ここで、プラスミドDNA抽出キットを用いて抽出した複数コピーのプラスミドDNAを、形質転換実験に使用します。

遺伝子工学のプロセス。

宿主のゲノムに形質転換すること。

組換えDNAをレシピエント細胞または宿主ゲノムに輸送することは、また別の面倒で困難な作業である。

形質転換のための様々な方法は、単一の方法をすべての細胞型に使用することはできないので、様々な細胞型に組換えDNAを挿入するために使用されます。

各種形質転換法：

ストレスを利用する-熱や電気ショックなどのストレス因子を利用すると、細菌は容易にプラスミドDNAを取り込むことができる。

マイクロインジェクション-鋭い針を使って細胞の核に直接DNAを挿入するが、この方法は効果が低く、専門的な知識が必要である。

エレクトロポレーション-最も成功率の高い方法の1つは、電流で細胞を透過させることにより、組換えDNAを宿主ゲノムに挿入する電気泳動法である。

私たちはこの方法について、記事全体を取り上げました。 こちらをお読みください。

超音波処理-遺伝子導入実験では、超音波を使って組換えDNAを標的細胞に挿入する方法もよく使われる方法です。 超音波は、細胞の透過性を高める効果もある。

リポソームによる遺伝子導入-リポソームと呼ばれる人工細胞状の外被を使って、組換えDNAを宿主のゲノムに挿入する。

細菌感染を利用した遺伝子導入-この方法は一般的な方法の一つで、植物の遺伝子工学実験に日常的に用いられている。 植物細胞に組換えDNAを挿入するために、アグロバクテリウム・ツミフェシアンが利用される。 アグロバクテリウムのTi-プラスミドに目的の遺伝子が挿入される。 この菌体培養により植物細胞を感染させ、形質転換された細胞を植物組織培養法を用いて再生させる。

遺伝子導入における化学物質-遺伝子導入実験には、いくつかの金属イオン、化学物質、異なる化学物質の溶液も用いられるが、成功率は他の方法と比較して低すぎる。

挿入を確認する。

まだ完成していません。

あとは、組換えDNAが目的の細胞に挿入されているかどうかを確認する必要があります。 そのために、さまざまな分子遺伝学的技術が使われています。 従来の培養法では、選択マーカーの有無によって、形質転換細胞と未形質転換細胞を区別していました。

ただし、PCRを用いた検出法では、その必要はない。

形質転換細胞からDNAを抽出し、目的の遺伝子や組み換えDNAに相補的なプライマーを用いて増幅し、検出する。

組換えDNAが存在すれば確実に増幅され、そうでなければ増幅されない。 2因子法の場合、組換えDNAに相補的なプライマーセットと選択マーカー配列に相補的なプライマーセットを採取し、マルチプレックスPCRを行う。

結果を検証するためには、両方の反応で増幅が得られることが必要である。

でもちょっと待って！

もし実験中に目的の遺伝子に変異が起こったらどうなるのだろう？ なぜなら、PCRはDNAを増幅することしかできないからです。 変異を検出するためには配列情報が必要なのです。

そのために、DNAの塩基配列を決定する方法を用います。

形質転換した細胞からDNAを抽出し、PCRで目的の遺伝子を増幅する。 PCRで増幅されたアンプリコンはDNAシークエンスに使用され、蛍光化学的手法により目的の遺伝子の配列が決定されます。

目的の遺伝子を決定するためのすべてのパラメータが満たされると、細胞は宿主生物に注入したり、組織培養実験に使用する準備が整います。

遺伝子工学の応用。

さて、このテーマの重要なポイントである「遺伝子工学は何に使われるか」ですが、

遺伝子工学は産業や農業に大きな価値をもたらします。 医療、遺伝子研究、農業、作物改良、治療薬の生産などで行われています。

また、遺伝子組み換え生物の開発にも利用されています。 ここでは、遺伝子工学の重要な応用例について説明します。

組換えDNA技術は、作物の改良や経済的に重要な新しい形質の開発に利用されています。 そのいくつかを紹介します。

• 除草剤耐性
• ウイルス耐性
• 果実の熟成遅延
• 油分の変化
• 花粉制御
• 耐寒および耐乾燥性植物種の開発。

  遺伝子組み換え植物種の開発プロセス：

  目的の遺伝子は、制限消化を使って生物から分離されるか、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅されます。 目的の遺伝子をプラスミドに挿入して組換えDNAを構築する。ここではT-プラスミドを使用する。

  次のステップで、T-プラスミドをアグロバクテリウムに挿入する。 最後のステップでは、植物種に形質転換された細菌細胞を感染させ、培養する。

  

  Agrobacterium-mediated gene transfer in plant species.

  GMF- 遺伝子組み換え食品も遺伝子工学の優れた応用例で、組み換えDNA技術を使って経済的に重要な食品を製造している。

  その典型的な例が、アンチセンスRNA技術で作られた遺伝子組み換えトマトのフラブラーサヴル（Flavr Savr）です。 遺伝子組み換えトマトは、ある場所から別の場所に簡単に運ぶことができるため、経済的な価値があります。

  綿花、トウモロコシ、大豆など、いくつかの食品の品質は、現在の組み換えDNA技術を使って改善されています。 遺伝子組換え作物や植物種の開発の目的は、経済的に重要で、栄養価が高く、タンパク質が豊富で、病気やストレスに強い作物にすることである。

  さらに、遺伝子工学と組織培養技術を使って、タバコ、ジャガイモ、トウモロコシ、綿の殺虫剤耐性植物種が開発されている。

  これに加えて、現在の遺伝子組換え技術を使って、自分で肥料を生成することができるいくつかの改良植物も作成することができる。

  トランスジェニックモデル生物は、さまざまなパラメータをテストするために開発されます。トランスジェニック微生物や動物モデルを設計することによって、特定の遺伝子の機能を決定することができます。

  有害な病原体や殺虫剤を、毒物を分解する能力を持つ遺伝子組み換え微生物を使って破壊することができる。

  医薬への応用。

  遺伝子工学の道具を使って、安価な薬、ホルモン、酵素、ワクチンなどが作られる。

  血栓を溶かすプラスミノーゲン活性化酵素を人工的に作り、冠動脈疾患や心臓発作の患者に使用する抗血液凝固因子はその最たる例である。

  他の例としては、ソマトスタチンとリンパカインという治療用タンパク質があり、これらはいくつかの病状に対して働き、人工的に合成することができる。 インスリンは、遺伝子工学技術を利用して設計された治療用タンパク質の典型的な例である。

  インスリンの遺伝子は、制限酵素法またはPCR法で単離され、プラスミドに挿入されます。 組換えプラスミドDNAは、直ちにプラスミドが増殖している細菌または酵母の細胞に挿入される。 微生物が分裂を始めると、人工インスリンを作り始める。

  同じ手法で工業的な規模で大量のインスリンを生産する。

  

  遺伝子組み換え技術によるインスリンの生産

  1982年にFDAの認可を得て、インスリンの商業生産が開始された

  インスリン生産の詳しい概要は下図に示す。

  組換えワクチン。

  天然痘、単純ヘルペスウイルス、肝炎に対するワクチンは、遺伝子工学の技術を使用して製造されています。 ワクチンは不活化されたウイルス粒子で、その病原体に対する免疫反応を誘導するために使用されるが、その分、汚染の可能性が高い。

  組換えDNA技術を使って、科学者はウイルスのコートタンパク質のDNAだけを含むユニークなタイプのワクチンを作り、病原体が再び活性化することがないようにしました。 このワクチンの主な利点は、より安全で、汚染がなく、反応性が高いということです。

  遺伝子治療における遺伝子工学。

  遺伝子治療や遺伝子導入の技術を用いると、遺伝性の遺伝子疾患を治すことができる。 嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、鎌状赤血球症などの遺伝子治療は、現在最終臨床試験段階にあり、患者への使用が可能な状態になっています。

  遺伝子治療では、欠陥のある遺伝子、機能しない遺伝子、変異した遺伝子を、上記と同じ手法で野生型の遺伝子に置き換えます。

  遺伝子治療については、こちらの記事で紹介しています。

  1. 遺伝子治療:

     遺伝子治療：種類、ベクター、プロセス、アプリケーションおよび制限

     遺伝子治療とは何か、どのように機能するのか？

  2. Naked DNAによる遺伝子治療
  3. Sleeping Beauty Transposon System:

  また、遺伝子工学技術は、バイオ燃料、病気、バイオアルコール、その他の必須製品の生産にも同様に使用されています。

  遺伝子工学の限界。

  遺伝子治療や遺伝子操作された製品の使用には倫理的な問題がある。

  また、食品やあらゆる遺伝子操作製品に経済的価値を与えるために、栄養価は損なわれてしまいます。

  その弊害で、新しい耐性病原体株の進化が早くなる。

  また、遺伝子治療の副作用や、それにウイルスを使用することは、対象生物に有害である。

  遺伝子治療は最大で5万ドルかかるため、技術が高価である。

  結論。

  胚や胎児を弄ることは自然法則に反するが、人々はそれを強く信じており、したがって遺伝子組み換え食品や植物製品は常に論争の中心となっている。

  しかし、遺伝子治療や遺伝子導入技術などの遺伝子工学ツールを使えば、遺伝性疾患や癌などの致命的な病気を予防することができます。 遺伝子工学の技術を積極的に活用することは、人類の運命を変えることにつながるのです。

  Sources:

  1. National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health.（「遺伝子組み換え食品の人体への意図しない影響の特定と評価に関する全米研究会議」）。 遺伝子組換え食品の安全性。 意図しない健康への影響を評価するためのアプローチ. ワシントン(DC)。 ワシントン（DC）: National Academies Press (US); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
  2. Wallace RB.による遺伝子操作の方法とメカニズム. 遺伝子操作の原理． 遺伝子操作の入門書. 微生物学の研究. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.