TAのダイナミクスの数理的特徴付け

TAのダイナミクスは、その構成要素がプロモーター上で時間的・空間的にどう編成されているかによって決定されます。 TAは多くの異なる配置状態を取ることができ、状態進化は多数の分子と複雑な相互作用が関与する本質的に確率的であるため、TAのダイナミクスを調べるために統計と確率の理論を採用した。 簡単のために、GTFなどの転写関連種の濃度はモデル遺伝子周辺で一定であり、プロモーターが関与する分子間相互作用は動的平衡にあると仮定する。 動的平衡とは、分子間相互作用がすべて可逆的であるという意味ではなく、TAがしばらくすると現在の状態を取り戻すことを要求しているに過ぎない。 モデル遺伝子とその周囲の生物種は一つのシステムを構成している。 上記の仮定は、そのような系が定常状態にあることを意味する。 このような本質的に同一のシステムが多数集まり、それぞれが独立に進化していく統計的アンサンブルを考えてみよう。 システムの数は、TAのすべての可能な構成状態をこのアンサンブルでカバーできるように十分な大きさである。 すなわち、個々の遺伝子が経るそれぞれの状態は、アンサンブル内の他の遺伝子の状態を写像し、特殊な状態X（例えば、エンハンサーが活性化因子によって結合された遺伝子）にある遺伝子の割合P（X）は、時間とともに一定に保たれる。 同様に、個々の遺伝子が任意の時間に観測された場合、その遺伝子が状態Xにある確率もP(X)である。 5056>

最小モデル（図1a）に対して、TAのすべての構成状態を普遍集合Ω、同じ重要な特徴を持つ様々な状態をそれぞれ以下の部分集合と定義する（図1b）。 Aはエンハンサーにアクチベーターが結合していることを示す。 Sは、コアプロモーターがSCFのタンパク質によって結合されていることを示す。 Mは、新生mRNAが妊娠中（PIC形成からPol IIの伸長への逃避までの過程を含む）であることを示す。 Jはエンハンサーに結合したアクチベーターがメディエーターを介してSCF、PIC、OPCに想定されることを示す。 真核生物の転写開始にはコアプロモーター上にSCFが存在することが必要であるため4,12、M⊂S. 定義によれば、J⊂AS. セットMJでは、MとAは同時であり、すなわち、エンハンサーに結合した活性化因子は、メディエーターを通して直接Pol IIの作用に影響を与えることができる。 したがって、活性化因子の直接制御下での転写開始はセットMJで記述され、一方、基底的な、活性化因子に依存しない転写開始はセットM-Jに含まれる。 妊娠中の新生mRNAの確率、すなわちmRNAが生成される確率は、

ここで、qは基底的な転写開始を表す定数、AjはAのサブセット（詳細は補足情報のS1参照）である。 Ajでは、エンハンサーに結合した活性化因子は、SCF、PIC、またはOPCが結合したメディエーターに接触することが義務づけられている。 (1)式は、mRNAの産生とTAの動的特性の関係を特徴づける。

転写活性化物質の濃度を表す

異なる転写段階におけるプロモータークロマチンの異なる構造に従って、エンハンサー結合活性化物質は、ヒストンのアセチル化を促進したりGTFsを勧誘したりと、様々な機能を果たすことができる4, 5, 15. 具体的には、エンハンサー結合型活性化因子には、基礎的な転写装置の取り扱いと転写開始の制御を担うものが含まれている。 さらに、これらの活性化因子の活性は、活性化因子の核内濃度の符号化とも関連しており、式（1）においては活性化因子の濃度に依存する唯一の因子であるからである。 ここでは、このような活性化因子の動態を調べる。

活性化因子は核内で高速に移動し、エンハンサーに到達する確率はその核内存在量に比例する9。 ここで、集合Ajに関与する活性化因子がエンハンサーに結合し、離脱する時間をm（m＝1、2、3、…）周期と考えることにする。 ここで、とはそれぞれj番目のサイクルの結合時間と非結合時間であり、これらの活性化因子の時間占有率RTORをと定義する。 核内の活性化因子の数がna固定である場合、

ここでaonとaoffはそれぞれ結合と非結合の傾向関数（詳細は補足情報のS2参照）であり、aonはnaの関数であるが、aoffはnaとは無関係である。 式（2）は、mが上昇するにつれて、＜9550＞は決定論的な値に収束し、それはnaの単調増加関数であることを示している（図1c〜dおよび図S1；これは一般的な特性であり、エンハンサー上の同族結合部位の数が1より大きい場合にも適用できる（式S13〜18を参照のこと））。 この収束は、活性化因子の濃度がほとんど変化しない時間枠の中で、活性化因子が十分頻繁にエンハンサーをオン・オフする場合、活性化因子の時間変化する濃度もRTORによってコード化できることを示唆している。 実際、活性化因子の急速な循環を保証するアクティブな解離機構が存在する9,19,20,21,22. 結合時間は数秒から数十秒の範囲と見積もられている9,10。 さらに、このような高速サイクルが機能的であることが、内在性CUP1遺伝子で証明されている10。 おそらく、RTORは転写活性化因子の濃度をコードしているのだろう。 一方、活性化物質がエンハンサーをm回循環する間に、そのような活性化物質によってエンハンサーが結合しているのを発見する確率は＜2185＞である。 アンサンブルにわたるの平均もf(na)であるから、

信頼できる転写反応を保証する制約条件

転写イベントの発生が確率的であることを考えると、信頼できる転写反応を実現するには、活性剤の濃度を適時に表すRTORコードが転写量に高い忠実さで伝達されていれば良いことになる。 理想的には、P(S)、、の全てが1に等しければ、正確な情報伝達が達成されることになる。 以下、ランダムな揺らぎが存在する中で、これら3つの因子が十分に大きくなり、確実な転写反応が得られる条件を示す（図S2、S3がこの小節の直感的な説明となる）。

式（3）は、プロモーター上にSCFが持続しなければ、活性化物質の濃度が十分にコード化されないことを意味している。 従って、SCFはクロマチン構造が許す限り速やかに集合し、エンハンサーに結合した活性化因子よりもはるかに安定であるべきである（条件I）。 このようなSCFの安定性は実験的に確認されており、ヒト細胞ではTBP（TATA-binding protein、SCFのコアコンポーネント）のプロモーター上での結合時間は最大20分とされている11。 の場合、AjはJの発生の前提であり、RTORは活性化因子の個々の短い結合時間で決まるため、Ajの発生後すぐにJが発生するはずである（図S3）。 そうでなければ、RTORに関する情報はほとんど失われるか、あるいは転写開始を指示するために誤って利用されてしまう（JがMの前提条件であることに注意されたい）。 したがって、RTORコードを正しく伝達するためには、メディエーターは循環活性化因子との結合を待って行動し、アロステリーを介して情報を伝達する必要がある23,24,25（条件II）。 なぜなら、自由衝突のような他の種類の分子間相互作用では、活性化因子の結合時間に関する情報を正確に伝達することができないからである。 このようなメディエーターのアロステリズムは、これまでの研究でも支持されている26。 はJが受け継いだRTORに関する情報をどのように変換して転写物の量を誘導するかを決定している。 RTORは活性化因子の間欠的な結合に依存しているので、が大きいと、短い結合期間中に、転写物がかなり速い速度で生成されるはずである（図S2）（条件III）。 この特徴は、実験データの計算による推定によっても検証された（補足情報のS3参照）。 5056>

アクチベーター制御転写の動的機構

以上の3つの制約条件が、TAがどのように作動するかを決定している。 メディエーターとエンハンサーの間に比較的安定なクランプ状の空間が形成される状態が繰り返し生じる（図2；条件IとIIによる）。 SCFはあまり安定でないことが実験的に示されていたため11、この空間は一時的に構築される。 クランプ状の空間は遊離の活性化因子を引き寄せ、活性化因子の濃度によってRTORが決まり、急速に剥離する（式(2-3)による）。 この空間に活性化因子1分子が入り込むと、メディエーターにアロステリーが生じ、GTFや他の関連タンパク質が機能を発揮しやすい状況になる。 その結果、Pol IIは（条件IIとIIIに従って）非常に迅速に転写を開始／再開することができ、RTORは転写物の量を調節する。

このメカニズムは、プロモーターに関わる分子相互作用が次のようなエレガントな動的原理に従っていると示唆するものであった。 クランプ状の空間は一時的に形成されるのに対して、そこに定住する活性化因子よりもはるかに安定である。 活性化因子の濃度がほとんど変化しない短い期間でも、活性化因子は何度もこの空間に出入りすることができるので、活性化因子の濃度はRTORで適時表すことができる。 メディエーターはアロステリーを介して情報を伝達し、転写の再始動率は活性化物の循環率よりはるかに大きいので、RTORコードはmRNAの合成を指示するのに有効に利用される。 つまり、クランプ状の空間が、確実な転写反応の構造的基盤となっているのである。 このことは、TAを構成する分子の安定性が数桁違うことに大きく依存している。 クランプ状空間の半減期は約5分11、活性化因子の占有時間は数秒から数十秒10、アロステリーは通常ミリ秒から1秒以内で起こり23,24,25、転写を再開するには数秒かかる（補足情報S3参照）。

数値シミュレーションによるメカニズムの検証

提案した動的メカニズムをさらに検証するために、生理学的に現実的なパラメータを持つ遺伝子転写の単純化した確率モデルを構築した（詳細は補足情報の図S4とS4参照）。 このモデルはTAの主要な状態遷移を描き、また関連するクロマチンダイナミクスを簡単に記述することにより、転写活性化因子に対する転写反応を特徴づけることができる。 以下、「入力」と「出力」はそれぞれ活性化剤の核内濃度と遺伝子産物であるmRNAやタンパク質の量を表す。

まず、入力レベルが一定の場合の細胞内mRNAの数の時間変化を調べる(図3a)。 注目すべきは、一般的な見解14,27,28,29,30,31,32と一致して、mRNAがバースト的に産生される点である。 低レベルの入力の場合、2倍体細胞では一方の対立遺伝子が転写され、他方は沈黙しているため、バースト現象が見られる。 しかし、高レベルの入力に対しては、2つの対立遺伝子の両方が頻繁にバーストし、その和がほぼ一定になる。 5056>

最近の実験解析では、クロマチン環境が転写バーストの形成に中心的な役割を果たしているという可能性は排除された32。 ここでは、転写物のバーストは、クランプ状の空間が活性化因子によって占められたときに、Pol IIによる持続的な再始動に由来することを証明する（図4）。 つまり、mRNAの開始はそれ自体がバースト的である。 バーストは単なるノイズではなく、活性化因子の濃度を表すRTORコードの直接的な現れであり、mRNAの生成を誘導するものである」

次に、転写反応の平均的な入出力関係を調べました。 平均出力は入力のHill関数に似ており、システムバイオロジーでは遺伝子発現のモデルとして広く用いられている3,33,34(図3b)。 また、出力の標準偏差SDoutの入力に対する曲線はほぼベル型である(Fig. 3c)。 また、SDoutと平均出力の比35で定義される固有ノイズの強度は、入力と逆相関している（図3bの挿入部分）。 さらに、上記の特徴は、入力のわずかな変動（すなわち、外来ノイズ）に対して鈍感であり（図S5）、ノイズに対する転写反応の頑健性が示唆された。 これらの結果は、Saccharomyces cerevisiae36とDrosophila embryos37の両方における実験的測定とよく一致するものであった。 特に、SDout曲線の左側が右側よりも低くなっている。この特徴は、実験データ37とほぼ定量的に一致している（さらなる考察は補足情報のS5を参照）。 これに対して、上で提案した動的原理からの逸脱（活性化因子の循環が遅い、足場複合体／クランプ状空間が安定していない、／転写再始動率が低いなどの状況を含む）は、入力に確実に応答するTAの能力を低下させる（図S6）。

ショウジョウバエの胚で観察される入出力関係は、分子相互作用の限界を最大限に利用して実現すると考えられていた37，38，39． このような微視的な相互作用の性質は、マクロ的にはSDoutとして現れると統合される。 SDoutの曲線は、SDinの曲線と比較して、やはり全体的にベル型をしている（図1d参照）。 つまり、RTORコードのサインをそのまま出力に伝えることができる。 このことは、活性化因子の時間的占有率が転写を制御するために本当に利用され、メディエーターがアロステリーを介してその情報を伝達していることを裏付けている。 一方、SDout曲線は左右非対称であり、右側が高くなっている。 理由は明白である。 入力が非常に大きいとき、エンハンサーはほとんど常に活性化因子によって結合されているため、この変動は主にSCFの動的特性とPol IIsによる転写再活性化を反映しているのである。 さらにシミュレーションを行ったところ、SCFの安定性や転写の再活性化率を上げるとSDout曲線の右側が下がり、生理的な範囲を超えて強度を上げると初めて対称的な曲線になることが分かりました（図S6F）。 これは、P(S)との両方が確かに十分大きいことも検証している。 したがって、SDoutの特性は、微視的な転写機構を決定的に証明するはずである。

第三に、同じ入力にさらされた大きな細胞集団全体のmRNAレベルの分布を調査する（図3d）。 小さな入力の場合、バースト現象が特に顕著で、ほとんどの細胞はmRNAを持たないか、ほとんど持っていない。 これは、実験観察と一致している27,30,31。 しかし、入力が大きくなるにつれて、分布は徐々に正規分布になる。 aon/aoff >1 の場合は、入力が増えるにつれて分布が鋭くなる。 5056>

第四に、周期的に変化する入力に対する転写反応のシミュレーションを行った。 プロモーター上の微視的過程はかなり動的で確率的であり、TAの異なる構成要素は明確な安定性を示す(図3e)。 しかし、mRNAの量は入力に追従することができます。 これらの結果は、FRAPによって明らかにされた結果、すなわちTAが非常に動的な装置であることとよく一致する8,10,11,22。 一方、細胞集団間のプロモーターの異なる状態の分布の時間発展を特徴づけるクロマチン免疫沈降法（ChIP）シミュレーションでは、分布に強い規則性があることが明らかになった（図3f）。 エンハンサーに結合する活性化因子、プロモーターに結合するSCFとPol IIのパターンはいずれも入力に追随しており、mRNA転写産物は入力と同相で生成されるが、ヒストンは逆相でプロモーターを占拠していることが明らかになった。 これらの結果はすべて、実験結果とよく一致している22,40。 したがって、FRAP実験とChIP実験の結果の間に観察される不一致は、測定に関わる解像度の違いに由来するものと考えられる。 ChIP測定では、分子間相互作用が時間的・細胞集団的に統合されるのに対し、FRAPでは瞬間的な相互作用がより厳密に反映される。 さらに、時間的に変化する入力に対する転写反応は、外来ノイズには強いが、複合入力信号には敏感であり、動的原理からの逸脱（活性化剤の循環率が低い場合、不安定な足場複合体/クランプ状空間、転写再始動率が低い場合など）は、反応能力を低下させる（図S7とS8参照）

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