タンパク質は他のタンパク質と作用して機能複合体を形成することが必要である。 例えば、DNA上のエピジェネティックな情報を調節するタンパク質にとって、このことは非常に重要である。 クロマチン修飾タンパク質のほとんどは、ヒストンのアセチル化、脱アセチル化、メチル化、脱メチル化に必要な補酵素を提供する代謝酵素との強い相互作用を必要とします3-5。このことから、タンパク質の機能や活性状態を解析するためには、与えられたタンパク質の複合体環境を調べる必要があることがわかります。 XL-MSでは、近接したタンパク質残基を共有結合させることができる特殊な化学試薬（架橋剤）が必要であり、例えば、複合体中で相互作用しているタンパク質残基を結合させることができます。 まず、架橋ペプチドの同定は、1つだけでなく2つの連結したペプチドのフラグメントイオンを分析することによって行わなければならないため、MS2スペクトルが非常に複雑になってしまう。 第二に、架橋されたペプチドの存在量は非常に低く、架橋されていないペプチドが圧倒的に多いペプチド混合物の一部であることです。 多くの場合、これは劇的な情報の喪失につながり、正確なクロスリンクの同定、ひいてはインタラクトーム解析の妨げになる。 このような問題に対処するため、MS切断基を導入し、XL濃縮が可能な架橋試薬がいくつか開発された12-18

ここでは、濃縮可能で、正確な架橋の同定が可能な切断特性を持つ新しい架橋試薬の開発について報告する。 設計したcliXlink（1）を図1に示す。 この細胞透過性試薬（図1 Aおよび参考情報の図S1）は、タンパク質中の求核剤と反応可能な2つのスクシンイミジルエステルユニットを約9Å間隔で配置しており、タンパク質の構造情報を得るための短距離固定や近接したタンパク質同士の捕捉が可能であることが特徴である。 また、スルホキシド基は、ペプチド断片化の前に低エネルギーの衝突誘起解離（CID）条件下で切断できるため、効率的なMS切断性が確立されている。 さらに、アルキンユニットにより、例えばビオチンのような濃縮部位をCuAAC反応の助けを借りて架橋部位に結合することができる19

クロスリンカーの使用は、図1のBに描かれたワークフローに従うことができる。これは、複合プロテオームへの試薬1の添加、近接したペプチドのネイティブ状態の距離情報の固定、MS分析のためのさらなるワークフローを通してのそれらの保存を含んでいる。 濃縮のための親和性基の付着は、かさ高い濃縮基による干渉を避けるために、架橋後に行われる。 架橋されたペプチドをタンパク質レベルで修飾することにより、過剰な低分子試薬はアセトン沈殿により容易に除去することができる。 この後、タンパク質を酵素で消化する。 このようにして、架橋されたペプチドは、例えばビオチンで標識され、濃縮することができる。 その後、質量分析によって分析される。 架橋中の個々のペプチドの質量はすぐにはわからないため、特に複雑なサンプルの場合、架橋の特定は困難である。 このため、MS切断可能な試薬を使用する必要があります。この試薬は特定のフラグメントイオンを形成することによりMS2同定を容易にします20, 21。最高でもMS3実験も可能な試薬が必要で、そのためにはペプチドよりも先に架橋剤が切断されることが必要です。 これにより、ペプチドを分離してMS3による同定を個別に行うことができる。 試薬 1 はスルホキシドの両側にβ-水素原子を含むため、図 1 C に示すようにフラグメンテーションは 2 方向に起こる。このため、ペプチド（α、β）はきれいに分離し、各ペプチドについて 2 つのフラグメント（アルケンとスルフェン酸フラグメント、後者は水が失われるとチアルを形成）が生成する。 これにより、特徴的なΔm/z≈32を持つ2つの質量ペアが得られます。 重要なことは、フラグメンテーション経路a (図1 C) が優勢であることが観察されたことである。 したがって、α-ペプチドではアルケン断片が、β-ペプチドではチアル断片が主な開裂生成物である。 非対称的な開裂特性のため、シグナル強度のほとんどは1ペプチドにつき1つのフラグメントに保持され、MS3実験では優れた感度が得られると考えられる。

試薬1の合成は簡単である(Scheme 1)。 出発点はホモシステイン2の酸化ジスルフィド二量体であり、これを4-ペンチノア酸で処理してジスルフィド3を得る。 ジスルフィドの還元的開裂と、生成したチオールの3-ブロモプロピオン酸メチルによるアルキル化により、スルフィド化合物4が生成する。 両メチルエステルを5へけん化し、5を活性化ビススクシンイミジルエステル6へ変換した後、チオエーテルを酸化してスルホキシドを得ることにより、試薬1を総収量16 %で得ることができる。 特に重要なのは、試薬の純度が非常に高く、反応性エステル単位が両側で揃っていることである。 部分的な加水分解は避ける必要がある。 これは、最終的な沈殿精製によって確保された。 試薬1を酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒に溶解し、ヘキサンを加えて沈殿させた。

次に、1のMS特性を調べた。この目的のために、1をよく使われるモデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）に添加することにした。 図1のBに示したワークフローに従い、濃縮工程は行わずに行いました。 つまり、タンパク質溶液に1を添加し、室温、生理的pHで1時間反応させた後、タンパク質をアセトンで沈殿させ、バッファに再懸濁し（参考情報参照）、その後、トリプシンとLys-Cの混合物でタンパク質を消化した。

得られたペプチド混合物をC18 Tipカラムで脱塩し、HPLC-MS2によって分析した(図2)。 図2 Aは、例として2つの架橋されたBSAペプチド（α＋β）を示す。 インタクトな架橋の正確な質量 (m/z 677.1; 図2 B) を決定した後、フラグメンテーション特性を評価するために、前駆体に対してCIDおよびHCDフラグメンテーションを行いました (図2 C)。 25 %という低い規格化衝突エネルギーで、より選択的なCIDフラグメンテーション(架橋イオンの共鳴励起; Figure 2 C, top spectrum)を行うと、予想通り、わずかな数の強いシグナルしか得られません。 各ペプチドについて、チアル（α-/β-チアル）およびアルケン（α-/β-アルケン）フラグメントをもたらすクロスリンカーフラグメントにより、Δm/zが32（Δmrep）の2つの顕著な信号対が得られます。 前述のように、フラグメンテーション経路a（図1 C）が優先され、非対称な強度分布となる。 予想される無傷の分離ペプチドの形成が支配的であるため、この試薬はより洗練されたMS3実験に適しています。

本研究においては、HCDフラグメントを使用した。 この方法では、クロスリンカーの切断と同定に必要なペプチドフラグメントの形成を同時に行うことができます（図2 C、下段）。 クロスリンクとペプチドの認識に役立つように、HCDフラグメンテーションではアルケンとチアルのフラグメントをまだ提供することが重要です。 したがって、HCDのデータにより、MS2によるペプチドの同定が可能になります。

この成功によって、新しい架橋剤をより複雑な環境で検証することができるようになりました。 特に、CuAAC に基づく濃縮の可能性の付加価値を示したいと考えました。 この実験では、再び BSA タンパク質 (10 μg) を架橋し、アセトンで沈殿させ、架橋したタンパク質を再溶解し、続いて 7 (図 3 A) と CuSO4/tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) を添加してクリック反応 (図 S3 A) を行い、アスコルビン酸ナトリウムを添加して CuII から CuI に還元しました。 室温で1時間後、再度アセトン沈殿を行い、過剰なビオチンアジドを除去した。 その後、トリプシンおよびLys-Cを加えて消化を行った。

これらのペプチドを次にHEK細胞抽出物から得たタンパク質消化物（タンパク質の435μg、図3 B）と結合した。 この結果、非架橋ペプチドの膨大なバックグラウンドが形成された。 この大きなバックグラウンド内の架橋を分析すると（図3 C）、ごく少数の架橋スペクトルマッチ（平均CSM=5.0）、ユニークな架橋部位（平均ユニークXL=3.7）、およびタンパク質と反応する前に加水分解した1つのスクシンイミジルエステルであるモノリンク（平均5.3）だけが確認されます。 しかし、ストレプトアビジンコートした磁気ビーズで濃縮を行うと、クロスリンクの同定数は飛躍的に向上した。 ペプチド混合物を磁性粒子とインキュベートし、ビーズをバッファーで広範囲に洗浄（6×）し（参考情報参照）、ジスルフィドを穏やかに還元切断して「捕捉」した架橋を解放し、それによってビオチン部分を除去すると（図 S3 B）、平均で 95.0 CSM と 37.0 ユニーク XL、そして 184.3 モノリンクを検出することができるようになりました。 これは、CuAAC反応の非効率性や非架橋複合体のバックグラウンドによる干渉が原因であると考えられる。 しかし、この結果は、私たちの新しい架橋剤1が、非修飾ペプチドの膨大な量の中に架橋ペプチドを濃縮できることを示しており、架橋の少ない複雑なサンプルの分析が容易になることを示している。 当初、我々は1の非対称構造に懐疑的でしたが、このデータから、それにもかかわらず、多数の架橋が同定されることがわかりました。

まとめると、私たちの新しい架橋剤1は以下の利点を兼ね備えています。まず、試薬のサイズは構造プロテオミクスにおいて貴重な距離情報を得るのに理想的です。 また、この分子は細胞透過性があり、アルキンユニットが架橋反応に大きな干渉を与えることはない。 さらに、強固で効率的なスルホキシド断片化により、架橋の同定が容易になります。 1で架橋したペプチドをクリックケミストリーで官能基化できるため、多様な修飾や濃縮戦略が可能となり、低濃度架橋の解析ができる。 以上、本試薬1により、MS2およびMS3を用いた複雑なインタラクトーム解析への道が開かれた。

利益相反

著者は利益相反を宣言していない。