構造生物化学／タンパク質／X線結晶学

12月 13, 2021

admin

結晶中の電子とX線の相互作用により回折パターンが生じ、それは数学的には電子密度分布のフーリエ変換となります。しかし、X線を測定するための検出器は、回折したX線の振幅しか測定できず、フーリエ変換を利用して電子密度分布を求めるために必要な位相のずれは、この方法では直接測定することができない。これは、物理学の世界では「位相問題」と呼ばれている。簡単に言うと、測定したX線の振幅から位相は求められないということです。電子密度マップを得るためには、他の外挿をしたり、追加の実験をしたりしなければならない。密度マップが不十分な場合、化合物の物理的・化学的特性に関する既存のデータが助けになることが多い。また、パターソン合成と呼ばれる方法は、相の初期推定値を求めるのに非常に有効で、相が分からないタンパク質の構造を決定する初期段階には非常に有効な方法です。パターソン合成を使って、通常は重金属である原子を見つけ、その原子の位置から初期位相を推定し、初期電子密度マップを計算することで問題を単純化することができ、さらに他の原子の位置のモデリングに役立ち、位相推定をさらに向上させることができる。もう一つの方法は、分子置換法と呼ばれるもので、細胞内のタンパク質構造の位置を特定するものです。分子置換法以外にも、同型置換法、多波長異常回折法、単波長異常回折法、直接法などで位相問題は解決できる。

Molecular ReplacementEdit

位相問題は、位相を計算できる原子モデルを持つことにより解決することが可能である。関連するタンパク質の構造がわかっていれば、モデルは得ることができる。しかし、この原子モデルを構築するためには、新しい単位胞におけるモデルの向きと位置を決定する必要がある。そこで登場するのが、分子置換法（Molecular Replacement、またはMR）という手法です。 MRは、決定すべき未知のタンパク質構造と相同なタンパク質構造を持つユニットセルの向きと位置を特定する。得られた位相は電子密度マップの生成に役立ち、X線結晶構造解析実験で観察された構造に対するタンパク質構造モデルの位置の計算強度の生成に役立つ。

MR 法は高分子結晶構造を解くのにも有効である。この方法は、重原子誘導体やデータ収集を準備する必要がないため、構造決定に要する時間や労力が少なくて済む。また、鎖の追跡が不要なため、モデル構築が簡略化され、直感的な方法である。

この方法は2つのステップで構成されている。

相同モデルをユニットセルまたはターゲットに方向付ける回転探索
新しい方向付けられたモデルがユニットセルに位置付けられる並進ターゲット

Patterson-based (Molecular Replacement) Edit

Patterson mapは原子間ベクターマップで、ユニットセル内の各関連原子のピークが含まれています。パターソンマップが電子密度マップから得られたデータに基づいて生成された場合、モデルが正しい向きで正しい位置に配置されている場合にのみ、2つのパターソンマップは互いに密接な関係を持つはずである。これによって、未知のタンパク質構造の位置に関する情報を、その細胞とともに推測することができる。しかし、分子置換には問題があり、6次元で、向きと位置を指定するための3つのパラメータがあります。 Pattersonマップを使えば、パラメータのサブセットに分割して、それぞれの部分を別々に見ることができる。

Rotation FunctionEdit

回転関数は、分子がユニットセル内で並進しても、すべての原子が同じだけ移動するが原子間のベクトルは同じなので、分子の向きだけに依存して、位置には依存しない分子内ベクトルを持っている。未知の蛋白質構造のパターソンマップを、異なる配向の相同既知の蛋白質構造と比較する

File:MR Rotation Function.gif

図は分子をランダムに配向した状態（左）と、残りの分子内ベクトルと共に（右）

上記の構造に対するパターソンマップを示したもので、このように、分子内ベクターは、分子内ベクターと同じように配向する。分子内ベクトルは赤で示されている。

Classic Rotation FunctionEdit

向きを求めるには、回転軸とその軸の周りの回転角を決定します。軸（球の中心から球面上の点へのベクトル）を定義するために、2つのパラメータが必要になります。回転軸はz軸に平行に始まり、y軸の周りを角度ᶱで回転し、次にオブジェクトはz軸の周りを角度ᶲで回転し、最後に回転軸の周りを角度ᵠで回転する。これらは単位球の表面上の点を指定する。

ĸ/ᵠ/ɸの記述は、特定の回転角 (ĸ) で回転を探すときに有用である。例えば、2回回転はĸ=180°、6回回転はĸ=60°

Fast Rotation FunctionEdit

回転関数は、2つのパターソンマップまたはそれらのパターソンにおけるピークを比較することによって計算することが可能です。

Direct Rotation FunctionEdit

直接回転機能では、タンパク質構造を未知構造のユニットセルに配置し、配向した分子のパターソンと未知構造全体のパターソンとを比較することができる。

Translation FunctionEdit

既知の構造の方向がわかれば、そのモデル（電子密度マップ）は、相関関数が非対称ユニット内の相同なものの上にモデルを翻訳するベクトルを決定するために使われる構造要因を計算するために方向付けることができる。

タンパク質構造の正しい方向と翻訳の位相モデルによって、導出した位相から電子密度マップを導出するには十分正確である。電子密度マップは未知の構造のモデルを構築し、改良するために使用できる。

Multiwavelength Anomalous DiffractionEdit

X線はシンクロトロンという大きな機械で発生させる。シンクロトロンは電子を光速近くまで加速し、中空の大きな金属製の多角形のリングの中を移動させます。各コーナーで磁石が電子の流れを曲げ、電磁波の形でエネルギーを放出する。

シンクロトロンを使用する利点は、研究者がすべての結晶化した分子の複数のバージョンを育てる必要がなく、代わりにセレンを含む1種類の結晶だけを育てることができることです。そして、セレンの化学的性質に合わせて波長を調整することができるのだ。この技術は、「多波長異常分散法」と呼ばれている。結晶に異なる長さの波長を数回照射すると、最終的に回折パターンが現れ、セレン原子の位置が特定できるようになる。この位置を基準として、残りの構造を決定することができるのだ。

Isomorphous Replacement MethodEdit

この方法は、元のタンパク質結晶と、原子番号の大きな原子を少なくとも1つ追加した同種の結晶とのX線回折パターンを比較するものである。マックス・フェルディナンド・ペルッツ（1914-2002）により、低分子の構造決定に用いられ、やがてヘモグロビンの構造決定にも用いられた。完全同型とは、元の結晶とその誘導体が、タンパク質のコンフォメーション、分子の位置と向き、単位胞パラメータが全く同じであることである。完全同型結晶とその誘導体が持つ唯一の違いは、誘導体に重原子が加わったことによる強度の違いです。これらの違いは、手動またはSIR2002、SHELXD、nB、ACORNなどの自動パターソン探索手順によって特定することができ、このような情報はタンパク質の位相角を決定するものとして重要である。しかし、細胞の寸法が変化するため、完全な同型化はほとんど起こらない。重原子を持つタンパク質の場合、許容できるセル寸法の変化はdmin/4であり、dminは解像度の限界である。

手順編集

結晶構造のタンパク質の誘導体をいくつか用意する。
元のタンパク質とその誘導体のX線強度データを収集する。
パターソン関数を適用して重原子の座標を決定する。
重原子パラメータを精製してタンパク質の位相角を計算する。
タンパク質の電子密度を計算する。

誘導体は2種類の方法で作成されます。好ましい方法は、母液と同じ組成で、沈殿剤濃度をわずかに高めた溶液にタンパク質結晶を浸すことである。もう一つの方法は共結晶化であるが、結晶が成長しないか、非同型に成長するため、一般には使用されない。浸漬の手順は、結晶の孔の広さによって異なる。試薬が結晶中に拡散し、結晶中のすべてのタンパク質分子の表面にある反応部位に到達できるような孔の広さが必要です。

多波長異常分散法編集

多波長異常分散法（略称MAD）は、タンパク質やDNAなどの生体高分子の構造を決定し、相問題を解決するX線結晶学で利用される手法です。構造決定には、X線から大きな散乱を引き起こす原子、特に硫黄や金属タンパク質の金属イオンが必要である。セレンが天然の硫黄に取って代わることができるため、セレンがより一般的に使用されている。

この方法は、振幅以外の散乱回折に関するデータがない場合に、位相問題を解決するために使用されます。また、重金属原子がすでに蛋白質内に結合している場合や、蛋白質の結晶が同型でないためにMIR法では不向きな場合にも用いられる。この方法は、通常、第1遷移系列とその近傍の金属酵素を含む重金属溶液に多く用いられてきた。この実験を行うためには、強力な磁場源が必要であり、地下などの環境も考慮しなければならない。

単波長異常分散法編集

多波長異常分散法（MAD）に対して、単波長異常分散法（SAD）は1つの波長から得られる1セットのデータを使用する方法である。 MADとSADの主な違いは、SADでは結晶がX線ビームにさらされる時間が短く、分子への放射線損傷の可能性を低減できることです。また、SADは1つの波長しか使用しないので、MADよりも時間効率がよい。

単波長異常分散法から得られる電子密度マップは、位相のあいまいさを解決するために修正を加える必要があります。一般的な修正手法は溶媒平坦化であり、SADと溶媒平坦化を組み合わせた場合、結果として得られる電子密度マップは完全なMAD位相決定から得られるものと同等の品質となる。溶媒平坦化では、溶媒によって占有されたタンパク質分子間の間質性領域の電子密度を調整します。溶媒領域は、タンパク質と比較して比較的無秩序で特徴がないと仮定されます。溶媒領域の電子密度を平滑化することで、タンパク質の電子密度を解釈可能な程度に高めることができる。この方法はISAS、iterative single-wavelength anomalous scatteringと呼ばれている。

Direct MethodsEdit

直接法は得られたデータを使って相を回復することができる。直接法は、初期位相と拡大位相を三重関係を使って推定する。三重（トリオ）関係とは、ある反射の強度と位相が他の2つの強度と位相と関係することです。この方法を用いる場合、位相の確率分布は原子数の平方根に反比例するため、タンパク質構造の大きさが問題となる。直接法は位相問題の解決に最も有用な手法である

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