実行犯カスパーゼ-3とカスパーゼ-7は機能的に異なるプロテアーゼである
結果と考察
Caspase-3 と Caspase-7 は合成基質に対して異なる活性を示す。
カスパーゼ-3とカスパーゼ-7はアポトーシス時に、死を引き起こす特定の刺激に関係なく普遍的に活性化され、両プロテアーゼは多様なタンパク質基質を切断してアポトーシスの解体段階を調整すると広く考えられている（1, 2）。 しかし、これらのプロテアーゼが細胞死に対してどのような貢献をしているかは、まだ不明である。 カスパーゼ-3とカスパーゼ-7は、他の哺乳類カスパーゼと比較して、互いに最も近縁であるが、それでも、全体の56%の配列同一性と73%の配列類似性と、かなりの配列分岐を示す（Fig. 1A）。 これらのカスパーゼの基質嗜好性をより詳細に調べるために、我々は両酵素をHisタグ付きタンパク質としてバクテリアで発現させ、これらを均質になるように精製した（図1B）。 両カスパーゼをDEVD-AFCとポリカスパーゼ阻害剤zVAD-fmkの組み合わせで活性部位滴定した（Fig. 1C）。 活性部位滴定データに基づき、各酵素の活性濃度を正規化し、その後の実験でこれらの酵素を直接比較できるようにした（Fig.1D）。 次に、合成テトラペプチド基質のパネルを加水分解する能力という観点から、これらのカスパーゼを比較した。 Fig. 1Eに示すように、両カスパーゼはDEVD-AFCを優先的に切断し、その効率はほぼ同じであった。 一方、カスパーゼ-3はカスパーゼ-7よりもLEHD-AFCを効率よく切断したことから、これらのプロテアーゼは特定の合成基質に対して異なる活性を持っていると考えられる（Fig.1E）。
ヒトカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7による合成基質の加水分解。 (A)ヒトカスパーゼ-3とカスパーゼ-7の配列のアラインメント。 同一残基は黒くハイライトされている。 保存された活性部位残基はボックスで囲んだ。 (B) 精製した組み換えヒトカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7のSDS/PAGE解析、クマシー染色により可視化した。 各レーンに5マイクログラムの細菌由来の精製タンパク質をロードした。 (C) DEVD-AFCに対するリコンビナントヒトカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7の活性部位滴定。 カスパーゼは、表示量の不可逆的カスパーゼ阻害剤zVAD-fmkと37℃で30分間インキュベートした後、Ac-DEVD-AFCを基質として蛍光測定により各処理における残留カスパーゼ活性を測定した。 (D) 等モル量の活性カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7による加水分解の線形速度を、Ac-DEVD-AFCを基質とする蛍光測定によって測定した。 (E）等モル量（25nM）のリコンビナントカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7を、示された合成ペプチド基質を加水分解する能力について比較した。
Caspase-3 and Caspase-7 Exhibit Differential Activity towards Natural Substrates in Cell-Free Extracts.
Caspase-3 と Caspase-7 は合成基質 DEVD-AFC に対してほぼ同じ活性を示したが，これらのタンパク質は配列の相違から天然のタンパク質基質との相互作用は非同型である可能性が高い． そこで、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7が同じ効率で天然基質を切断するかどうかを調べた。 そこで、Jurkat細胞由来の無細胞抽出液に両カスパーゼを等モル量添加し、よく知られているカスパーゼ基質（1）を切断する能力を評価した。 これらの実験から、いくつかの基質は両プロテアーゼによって確かに同程度の効率で切断されたが（図2 AおよびB）、他の基質は切断されなかった（図2 CおよびD）ことが明らかになった
組換えカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7による天然基質およびカスパーゼのタンパク質分解。 Jurkat無細胞抽出物を、表示濃度の組換えヒトカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7と37℃で2時間インキュベートした後、表示タンパク質の免疫ブロッティングを行った。 (A と B) 両酵素によって同程度の効率で切断された基質。 (CとD) カスパーゼ-3とカスパーゼ-7による差のあるタンパク質分解を示す基質。 (E) in vitro転写/翻訳で調製した35S標識カスパーゼをリコンビナントカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7でタンパク質分解した。 反応は37℃で2時間行い、その後SDS/PAGEとフルオログラフィーで分析した。 (F と G) リコンビナントカスパーゼ-3 とカスパーゼ-7 による内因性カスパーゼの蛋白質分解。 Jurkat無細胞抽出物を、表示濃度の組換えカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7とともに37℃で2時間インキュベートした後、表示カスパーゼの免疫ブロッティングを行った。 結果は3つの独立した実験の代表的なものである。
特に注目すべきは、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7がともにRhoGDI、PARP、ROCK I、ICADなどのタンパク質を同様に切断するのに対し（図2 AおよびB）、これらのプロテアーゼはXIAPとゲルソリンに対する活性に明確な差を示し、Bidなど他の基質に対してはより穏やかな差が見られた（図2 CおよびD）点である。 調べた基質の大半はカスパーゼ-7よりもカスパーゼ-3の方が効率よく切断されたが、コカペロンp23はカスパーゼ-3よりもカスパーゼ-7の方がはるかに優れた基質であった（図2 C、D）。 このように、合成カスパーゼ-3/カスパーゼ-7基質であるDEVD-AFCを用いた場合とは対照的に、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7の酵素活性は、ゲルソリンやコファペロンp23などの天然基質に対して明らかに異なり、XIAPやBidに対してはより小さな違いが見られた。
Caspase-9 Is efficient processed by Caspase-3 but not Caspase-7.
アポプトソームによるカスパーゼ活性化カスケードにおいて、カスパーゼ3はカスパーゼ9へのフィードバック処理を行うことが示されている（4, 12）。 そこで、カスパーゼ-7がカスパーゼ-9を同様に処理することができるかどうかも検討した。 in vitroの転写型および翻訳型カスパーゼを用いて、カスパーゼ-3はカスパーゼ-9とカスパーゼ-6をカスパーゼ-7よりもはるかに効率的に処理することが観察された。これは、これらのプロテアーゼのプロフォームが消失し、その処理型が現れることに基づいている（図2E）。 また、カスパーゼ-9とカスパーゼ-6の供給源として無細胞抽出物を用いた場合にも、同様の結果が得られた（図2FおよびG）。 さらに、後者の実験では、リコンビナントカスパーゼ-3もリコンビナントカスパーゼ-7よりもはるかに効率的にカスパーゼ-2を処理することが示された（図2 FとG）。
Caspase-3 and Caspase-7 Display Divergent Activity towards Purified Substrate.
先の実験で見られた違いのいくつかは、無細胞抽出物中の内在性カスパーゼ（または他のプロテアーゼ）の活性化の違いによる間接的な効果に起因する可能性があった。 この可能性を排除するために、リコンビナント精製Bid、Rho-GDI、コカペロンp23を調製し、これらの基質のカスパーゼ-3とカスパーゼ-7によるタンパク質分解の効率を、より厳しい条件下で評価した。 図3 A、Bに示すように、これらの実験は、無細胞状態で観察されたものと同じであり、同じ条件下でBidはカスパーゼ3によって効率的にタンパク質分解を受けたが、カスパーゼ7によって切断されることはなかった。 しかし、コカペロンp23の場合は逆で、カスパーゼ-3よりもカスパーゼ-7によって効率よく切断された（図3 A、B）。 さらに、RhoGDIは両方のカスパーゼによって等しく切断された（図3 AおよびB）。 時間経過の解析により、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7が特定の基質を選択することがさらに明らかになった。 注目すべきは、これらのデータが、無細胞抽出物で得られた以前の観察結果 (Fig. 2 A-D) を忠実に再現していることである (Fig. 3)。
Bid およびコカペロン p23 は、ヒトおよびマウスのカスパーゼ-3 およびカスパーゼ-7 によるタンパク質分解の差異を示す。 (AおよびB) 組み換えBid、Rho-GDI、およびコカペロンp23を、表示濃度のカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7と37℃で2時間接触させ、反応生成物をSDS/PAGEで分離し、クーマシー染色（A）または免疫ブロッティング（B）によって視覚化した。 なお、バクテリアからダブレットとして精製されたリコンビナントBidは、質量分析により両種がBidタンパク質であることが確認された。 2つの形態のBidの移動度が異なる理由は明らかではないが、タンパク質の部分的なミスフォールディングに関連している可能性がある。 (C) 精製Bid、Rho-GDI、コカペロンp23のカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7によるタンパク質分解の時間経過解析。 基質を200nMのリコンビナントカスパーゼ-3またはカスパーゼ-7と37℃でインキュベートし、表示された時間にサンプルを採取した。 反応生成物はSDS/PAGEで分析し、イムノブロットで可視化した。 (D）デンシトメトリー分析を行い、800nMの各カスパーゼを用いて組換え精製Bid、Rho-GDI、またはコカペロンp23を切断した図S1に示す各処理について、時間経過によるタンパク質分解のパーセントを算出した。 (E）マウスJ774無細胞抽出物を、表示濃度の組換えマウスカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7とともに37℃で2時間インキュベートし、続いて表示タンパク質について免疫ブロッティングを行った。 結果は3つの独立した実験の代表である。
マウスカスパーゼ-3およびカスパーゼ-7も天然基質に対して差のある活性を示すかどうかを調べるために、マウスJ774無細胞抽出物を用い、これらの抽出物に組換えマウスカスパーゼ-3とカスパーゼ-7を滴定し、p23、ビド、ROCK Iおよびいくつかの追加の基質について免疫ブロッティングを実施した。 図3Eに示すように、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7によるp23とBidの差異あるタンパク質分解が再び観察され、一方、ROCK IとRhoGDIは同じプロテアーゼによって同様の効率で切断された。
カスパーゼ-3を免疫除去したJurkat無細胞抽出物を用いて、我々は以前、このプロテアーゼが、アポトーシスの終末期に通常切断されるカスパーゼ基質の小さなパネルのタンパク質分解に絶対必要であることを示した(11)。 カスパーゼ-3はカスパーゼ-7よりも基質に対してよりプロミスキャスであることが示唆されたので（図2）、カスパーゼ-3除去の影響をよりグローバルに視覚化するために、二次元ゲル分析を使ってカスパーゼ-3除去Jurkat抽出物の分析を繰り返した（図4）。 このとき、カスパーゼの活性化は、抽出液にシトクロムcとdATPを加えることで達成された。これらの因子は、カスパーゼ9の下流でカスパーゼ3とカスパーゼ7を活性化するApaf-1/カスパーゼ9依存性のカスパーゼ活性化カスケードを開始させるからである(4)。 これらの実験から、カスパーゼ-3を除去すると、この系で見られるカスパーゼ依存性のタンパク質分解変化の大部分が消失し、カスパーゼ-3除去抽出液でタンパク質分解を受けるタンパク質はほとんどないことが明らかになった（図4B）。 興味深いことに、カスパーゼ-3を除去した抽出液でタンパク質分解を受けた少数のタンパク質のうち、1つはコ・シャペロンp23と同定され（図4C）、このタンパク質がカスパーゼ-7の少数の好ましい基質の一つであることが確認された
カスパーゼ-3の枯渇は、シトクロムc/dATP誘発のカスパーゼ依存性のプロテオームへの変化の大部分を無効にする。 (A)モック欠失またはカスパーゼ3欠失Jurkat無細胞抽出物を、示したようにチトクロームc/dATPの存在下または非存在下で37℃、2時間インキュベートした。 各反応のサンプル（各処理につき350μg）を二次元SDS/PAGE分析に供し、その後、銀染色によりタンパク質を可視化した。 未処理対照ゲルでは検出されなかった新規タンパク質分解断片に対応するタンパク質スポットを赤い矢印で示し、対照に存在するがシトクロムc/dATP処理サンプルでは検出されないタンパク質スポットを黄色の矢印で示す。 (B) シトクロムc/dATP処理したモック除去抽出物またはカスパーゼ3除去抽出物において検出された変化のおおよその総数を示すヒストグラムである。 (C) Aで概説したゲルのズームした領域。矢印で示したタンパク質が質量分析によりコカペロンp23の切断断片であることが確認された。
細胞内で起こっているアポトーシス関連のタンパク質分解の大部分をカスパーゼ-3が担っているかどうかを調べるために、CASP-3遺伝子内の自然欠失によりカスパーゼ-3の発現が欠損しているMCF-7ベクター細胞を使用した(13)。 図5Aが示すように、カスパーゼ3欠損MCF-7細胞では、カスパーゼ3を再構成したMCF-7細胞（MCF-7Casp-3）と比較して、様々なカスパーゼ基質のタンパク質分解が大きく損なわれていた（図5Bおよび図S2）。 しかしながら、カスパーゼ-7の優れた基質であることが判明したコカペロンp23およびPARPのタンパク質分解は、カスパーゼ-3の非存在によって影響を受けなかった（図5A）。 さらに、カスパーゼ-7のshRNAによるノックダウンは、同じ条件下でコカペロンp23のタンパク質分解を大幅に抑制したことから、アポトーシスの解体期におけるこのタンパク質のタンパク質分解はカスパーゼ-7が実際に担っていると主張した（図5CおよびD）
CASP-3欠損MCF-7細胞は、コシャペロンp23とPARPを除く複数のカスパーゼ基質の切断に失敗している。 (A）未処理のまま（UT）、またはアクチノマイシンD（ActD；5μM）もしくはシスプラチン（Cis；100μM）の存在下で22時間培養したカスパーゼ-3欠損（MCF7vector）細胞またはカスパーゼ-3再構成（MCF7Casp-3）細胞の溶解物内の示されたカスパーゼ基質のイムノブロット分析。 (B）Aにおける対応する処理に対する細胞死カウントは、材料および方法に記載されているように、形態学的基準に基づいて実施された。 (C）1μgのCASP-3またはCASP-7 shRNAプラスミドで72時間トランスフェクトし、続いてActDまたはシスプラチンで15時間処理したカスパーゼ-3欠損（MCF7vector）細胞から生成したライセートのイムノブロット（D）Cで処理した細胞について対応する細胞死の数。 結果は、3つの独立した実験の代表である。
これらの結果を総合すると、カスパーゼ-3またはカスパーゼ-7を欠く細胞およびマウスで観察される異なる表現型に対する生化学的根拠が提供される。 カスパーゼ-3 はよりプロミスキャスなプロテアーゼであるようで、この結果は一般に CASP-3 欠損に関連するより深刻な一連の欠陥と相関している。 しかし、PARP、Fodrin、ROCK Iなどの特定の基質に対しては、この2つの酵素の間にある程度の重複があるように見える。この研究で調べた20種類の基質のうち、12種類はカスパーゼ3によって優先的に切断されたが、1種類（コカペロンp23）だけはカスパーゼ7によってよりタンパク質分解を受けやすくなっていた。 もしこの図が代表的なものであれば、これらの酵素は密接に関連し、どちらもアポトーシスの解体期に活性化されるが（14）、カスパーゼ-3とカスパーゼ-7は明らかに異なるプロテアーゼで、細胞死装置において重複しない役割を担っていることを示唆している。