哺乳類ヘキソキナーゼのアイソザイム：構造、細胞内局在、代謝機能｜Journal of Experimental Biology
Type I isozyme
図1からもわかるように、ヘキソキナーゼは、グルコースが代替代謝経路に入るゲートウェイとして働いています。 しかし、ヘキソキナーゼは解糖系酵素であり、解糖系代謝は一般に細胞質内のプロセスであると考えられていると言ってよいだろう。 したがって、他の解糖系酵素とは異なり、ヘキソキナーゼ活性（現在ではTypeIアイソザイムとして知られている）が脳ホモジネートの「微粒子画分」に多く見出されたことは注目に値する（CraneとSols、1953年）。 その後の研究(Johnson, 1960;Rose and Warms, 1967; See also Wilson, 1995)で、粒子状のヘキソキナーゼはミトコンドリア、より詳細にはミトコンドリア外膜に結合していることが示された(Rose and Warms, 1967;Kropp and Wilson, 1970)。結合は疎水性のN末配列に決定的に依存しており（Polakis and Wilson, 1985）、タイプIアイソザイムをミトコンドリアへ選択的に標的化していた (Gelb et al., 1992;Sui and Wilson, 1997）、結合の過程でミトコンドリア外膜の疎水性コアに挿入される（Xie and Wilson,1988）。 ポリン（Voltagedependent Anion Channelの頭文字をとってVDACとも呼ばれる）は、代謝物がミトコンドリア外膜を通過するチャネルを形成し、ヘキソキナーゼと相互作用するミトコンドリア外膜タンパク質として同定された（Elgnerら, 1979;Lindén ら, 1982;Fiek ら, 1982）。 さらに、ヘキソキナーゼの結合は、ミトコンドリア膜の内側と外側が密接に接触している領域である接触部位に位置するポリンに優先的に起こるという見解を支持する証拠がある(Dorbani et al., 1987;Kottke et al..)。 Johnson(1960)とRose and Warms(1967)の古典的な研究に続いて、脳以外の正常組織や腫瘍細胞からミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼが報告されました（参考文献：Wilson, 1985,1995 参照）。 解糖系酵素が酸化的代謝の主要な場であるミトコンドリアと結合することの潜在的な生理学的意義は、多くの憶測を呼んできた。 特に、ミトコンドリア外膜の「ヘキソキナーゼ結合タンパク質」がポリンと同一であり、ヘキソキナーゼはATPがミトコンドリアから出る（そしてADPがミトコンドリアに再び入る）点の近くに位置しているかもしれないということが認識されて以来、早い時期から、特に、ミトコンドリア外膜の「ヘキソキナーゼ結合タンパク質」は、ミトコンドリアの「ポリン」と同一であることが分かってきている。 この近接性が、基質ATPの供給源としてのミトコンドリア内酸化的リン酸化と、ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼによるGlcリン酸化との間の密接な代謝的相互作用を促進する可能性に主に焦点が当てられていた。 このことは、Rose and Warms(1967)によっても検討されたが、彼らの実験結果からは支持されなかった。 しかし、その後の他の研究者（参考文献：Wilson,1985,1995）により、様々な供給源からのミトコンドリア結合ヘキソキナーゼを用いて、ミトコンドリア内生成ATPに優先的あるいは特権的にアクセスできるという見解が支持される証拠がもたらされた。
我々の研究室での研究は、活発にリン酸化している脳のミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼは、酸化的リン酸化によって生成された基質ATPのミトコンドリア内の区画に実際に密接に結合しているという見解の確固たる根拠を提供した。 この結論に対する実験的な裏付けは、一連の出版物で述べられている（BeltrandelRio andWilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar and Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto and Wilson, 2000）。 これらの研究を完全にレビューすることは、現在の文脈の制約内で不可能であるが、我々は、これらの研究で利用されている、すべてが同じ結論につながる、様々な実験的アプローチを明らかにするために、主要な知見のいくつかを強調する。
最初の研究 (BeltrandelRio and Wilson,1991,1992a,b) は分光光度法を用いて行われ、様々な体内過程（酸化的リン酸化、アデニル酸キナーゼ反応、クレアチンキナーゼ反応）によるATP生成とヘキソキナーゼによるグルコリン酸化がNADPH生成と関連付けられ、適切なカップリング酵素を用いて340 nmでモニターされた。 基本的な考え方は、Glcリン酸化の速度と様々なソースからのATP生成の速度を比較することによって、ヘキソキナーゼの基質ATPソースとしての様々なミトコンドリア内ATP生成プロセスの相対的重要性を推論することであった。 そして、その結論は、酸化的リン酸化が起こっているときには、アデニル酸キナーゼもクレアチンキナーゼも基質ATPの重要な供給源にはならない、ということであった。 さらに、酸化的リン酸化によって生成されたATPの一部のみがヘキソキナーゼによって利用され、酸化的リン酸化が継続するにつれてエキストラミトコンドリア培地中が増加し続ける結果となった。 しかし、Glcリン酸化速度は、酸化的リン酸化がない場合のATPのKmと同程度であり、ヘキソキナーゼがATPを基質として「飽和」することはなかった（図2）。 このことは、基質として使用されているのが外膜型ATPではないことを強く示唆している
ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによるグルコース（Glc）のグルコース-6-リン酸（Glc-6-P）へのリン酸化と外因性ATPまたは酸化的リン酸化によるATPを用いたリン酸化。 Glcリン酸化の速度は、酸化的リン酸化がないときに外部から加えた等量のATP（三角形）または酸化的リン酸化によって生成したATP（丸）で決定された。 いずれの場合も、Glcリン酸化速度は飽和レベルであり、飽和レベルの外来ATPを添加して急性にATPレベルを上昇させた場合（四角）よりもはるかに低い。 BeltrandelRio and Wilson(1991)の許可を得て転載）
このことをさらに裏付けるのが、図3に示すような結果であった。 ここでは、ADPを添加して酸化的リン酸化を開始した後、最初から高濃度の軟骨外ATPを存在させた状態でGlcリン酸化をモニターしています。 古典的なMichaelis-Mentenkineticsから予想されるように、Glcリン酸化の初期速度は軟骨外ATPの増加に伴って増加した。 しかし、時間とともに、残存するエキストラミトコンドリアATPの量に依存しない定常状態のGlcリン酸化速度が達成された。 この結果は、ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼは当初はミトコンドリア外ATPを使用していたが、酸化的リン酸化が始まると基質選好性が変化し、ヘキソキナーゼは酸化的リン酸化速度によって決まるミトコンドリア内ATP区画に依存し、ミトコンドリア外とは独立になったことを示していると解釈できる
ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによるグルコース（Glc）リン酸化と、高濃度の外来ATP存在下で酸化的リン酸化により生成されたATP。 酸化的リン酸化によるATP生成は、指定された時間にADPを添加することにより開始された。 グルコース6-リン酸（Glc-6-P）デヒドロゲナーゼが過剰に存在すると、Glcリン酸化はNADPH生成と結合し、340 nmの吸光度（A）によってモニターされた。 ADP添加時の外来ATP濃度は、曲線A-Dでそれぞれ1.1, 0.66, 0.22, 0 mmol l-1であった。 8651>
ADP添加による酸化的リン酸化の開始後、ほぼ直ちにATP生産が始まったが、ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによるGlcリン酸化の開始には著しい遅れがあり（図3D）、定常状態に達するまでの時間は長くなった。 この最初の遅延時間は、ミトコンドリア内コンパートメントが酸化的リン酸化によって生成されたATPで満たされ、そこからミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼが基質ATPを引き出すのに必要な時間だと解釈された。 KCNの添加により電子輸送が阻害されると、ATPが明らかに放出され、このコンパートメントの特性（充填の速度論、コンパートメント内のATP産生との関連性など）が明らかになった。残念ながら、期待との一致は真実への絶対的なガイドではなく、「ATPの見かけの放出」はその後、人工物であることが判明した（Laterveerら、1993）。その原因はいまだ解明されておらず、その後の研究でも再現できなかった（deCerqueira Cesar and Wilson, 1998）。 8651>
分光光度法の代替として、二重同位体標識法が開発された(deCerqueira Cesar and Wilson, 1995)。 14C標識Glcはヘキソキナーゼの基質として使用され、32Piは酸化的リン酸化によるATP合成の基質として供給された。 Glc-6-Pの32P/14C比は、ヘキソキナーゼが基質ATPを利用する際の特異的な活性を示す指標となった。 ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼが生成するGlc-6-Pの32P/14C比を、ミトコンドリアに結合しないため必然的にミトコンドリア外ATPを基質とする酵母ヘキソキナーゼが生成するGlc-6-Pと比較検討したところ、ミトコンドリア外ATPを基質とする酵母ヘキソキナーゼは32P/14C比が高いことが分かった。 ミトコンドリア結合型と酵母型ヘキソキナーゼの基質となるATPプールの標識の動態は著しく異なり、ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼはミトコンドリア外のATPを基質にせず、酸化的リン酸化によって供給されるミトコンドリア内のATPを利用しているという見解と一致する。例えば（図4）、過剰な31Piを添加すると、酸化的リン酸化によって合成された32P-ATPの特異的活性が著しく低下し、酵母ヘキソキナーゼがミトコンドリア外ATPを用いて生成するGlc-6-Pの32P/14C比が急速に減少した。 一方、ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼが生産するGlc-6-Pの32P/14C比は、遅れて、その後、ややゆっくりと減少した。 後者の観察は、ミトコンドリア・ヘキソキナーゼがミトコンドリア外のATPと自由に平衡化できないミトコンドリア内のATPコンパートメントを利用しているという見解と再び一致した。
ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼまたは非ミトコンドリア結合酵母ヘキソキナーゼが生成するグルコース-6-リン酸（Glc-6-P）の32P/14C比に対する過剰な非標識Pi添加の影響酸化的リン酸化のために32Pipが、またヘキソキナーゼの基質であるグルコースが存在して、酸化的リン酸化が開始された。 3分後に過剰の31Piを添加し、酸化的リン酸化によって生成されるATPの比活性を低下させた。 その結果、酵母ヘキソキナーゼ（四角）が細胞外ATPを基質として生成するGlc-6-Pの32P/14C比は急激に減少したが、ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼ（開丸）が生成するGlc-6-Pの32P/14C比ははるかに緩やかに減少することが示された。 塗りつぶした円は、ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによって生成された全Glc-6-P。 8651>
さらに別の実験的アプローチは、ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼと非結合酵母酵素の比較に基づいていた（de CerqueiraCesar and Wilson, 1998,2002）. その論理はFig.5に示されている。 ヘキソキナーゼが結合した一定量の脳ミトコンドリアを、ヘキソキナーゼが結合していないラット肝臓ミトコンドリアと混合する。 脳と肝臓のミトコンドリアはともに活発にリン酸化を行っており、肝ミトコンドリア量の増加とともにATP生成量も増加する。 このとき、ミトコンドリア外ATPの濃度は、ミトコンドリア外ATPを基質とするヘキソキナーゼのÅKm（酸化的リン酸化がない場合）、つまり過飽和状態に保たれるように設計されています。 ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼがミトコンドリア外ATPを基質としている場合、肝ミトコンドリアの添加量を増やしてATP生産速度を高めると、Glcリン酸化速度が徐々に増加することが予想される。 しかし、実際には、肝ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼによるGlcリン酸化速度は、ATP産生速度の増加にあまり影響されない（Fig.6）。 一方、ミトコンドリアのヘキソキナーゼを同量の酵母ヘキソキナーゼに置き換えると、期待通りのGlcリン酸化速度の増大が見られた。 これらの結果は、ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼが、ヘキソキナーゼが結合しているミトコンドリアに内在するミトコンドリア内ATPを使用しているが、ヘキソキナーゼを含まない肝臓ミトコンドリアから発生するミトコンドリア外ATPの増加には無関係であるという見解と再び一致している
ミトコンドリア結合ヘキソキナーゼまたは非結合酵母ヘキソキナーゼによるミトコンドリア外ATPの利用を比較するための実験戦略の模式図である。 (A）ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼ（HK）をパネル中央に、結合型ヘキソキナーゼをほとんど含まないミトコンドリアを周辺部に示した。後者については、グルコース6-リン酸で処理し、ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼを放出させたラット脳ミトコンドリアを以前の実験で使用した。 しかし、後期の実験では、結合したヘキソキナーゼを持たないラット肝ミトコンドリアを単離したものを使用した。 ミトコンドリア外ATPはミトコンドリア外腔に分布している。 (B）同様の状況だが、ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼの代わりに、非ミトコンドリア結合型酵母ヘキソキナーゼ（YHK）を同量使用した場合。 基本的な戦略は、一定量の結合型あるいは非結合型ヘキソキナーゼによるグルコースリン酸化速度を決定し、結合型ヘキソキナーゼを持たないミトコンドリアを徐々に追加してミトコンドリア外ATP生産速度を増加させるというものである。 de Cerqueira Cesar and Wilson(2002)の許可を得て転載。
ミトコンドリア結合型および非結合型ヘキソキナーゼによるグルコース（Glc）リン酸化速度、酸化的リン酸化によるATP生成速度の増加。 Glcリン酸化速度(v̇)は最大リン酸化速度(V̇)に対する相対値で、後者は酸化的リン酸化がない状態で外来ATPを飽和レベルにして決定されたものである。 ミトコンドリア結合酵母ヘキソキナーゼによるGlc-6-P生成速度（○）は、ATP生成速度と密接な相関がある。 一方、ミトコンドリア結合型ヘキソキナーゼによるGlcリン酸化速度（四角）は、ヘキソキナーゼを持たないミトコンドリアが生成するミトコンドリア外ATPレベルの増加に対して感受性が低く、ミトコンドリア結合型酵素は、酵素が結合したミトコンドリアが生成するミトコンドリア内ATPを基質に限定されていると考えることができる。 8651>
最後に、ミトコンドリアに結合したヘキソキナーゼがミトコンドリア内と外のATPを識別できるという見解に対するさらなる証拠は、Glc-6-Pアナログ、1，5-アンヒドログルシトール-6-P（1，5-AnG6P）による阻害を調べることから得られた。 酸化的リン酸化がなく、エキストラミトコンドリアATPを基質とする場合、1,5-AnG6PはATPに対して競合的に、かなり強力な阻害剤となる（図7）（Hashimoto and Wilson,2000)。 一方、酸化的リン酸化によってATPが供給されると、1,5-AnG6Pは阻害剤としての効果が非常に低くなる。 このことから、酸化的リン酸化によって供給されるATPはミトコンドリア外ATPと等価ではないことがわかる。 同様の結果は、ウシ脳由来のヘキソキナーゼを用いて最近報告されている(de Cerqueira and Wilson,2002)。
グルコース-6-リン酸アナログである1,5-アンヒドログルシトール-6-P（1,5-AnG6P）による、ミトコンドリア内（開丸）またはミトコンドリア外（充填丸）のATP基質と結合したヘキソキナーゼの阻害効果。 8651>
要するに、酸化的リン酸化がない場合、ミトコンドリアのヘキソキナーゼは古典的なミカエリス-メンテン速度論に従って、容易に軟骨外のATPを利用できるというのが現在の見解である。 しかし、酸化的リン酸化が活発に行われている間は、ミトコンドリアに結合した酵素はミトコンドリア内のATPプールと結合し、Glcリン酸化の速度は酸化的リン酸化の速度と密接に相関している。 リン酸化速度は変化するのですか？ もちろん、エネルギー需要の変動によって変化します。 しかし、本当にリン酸化していないかというと、おそらく最も過酷な、そして最終的には死に至るような状況下においてのみであろう。 したがって、通常の条件下では、Glcリン酸化の速度は、ミトコンドリアで起こるGlcm代謝の最終酸化段階と、それに伴う酸化的リン酸化によるATP産生と密接に関連していると考えられる。 先に述べたように（BeltrandelRio and Wilson,1992a）、このような調整により、末端の酸化段階に見合った速度で解糖系代謝にGlcを導入し、神経毒性の乳酸（Marie and Bralet, 1991）の生成を回避しながら、エネルギー需要を満たすのに十分な速度で経路の細胞質およびミトコンドリア部分を通して正味フラックスを確保できる（図 8）
グルコース（Glc）代謝の解糖相と酸化相の調整。 ミトコンドリア内で生成されたATPを基質とするミトコンドリア結合ヘキソキナーゼによるGlcリン酸化速度は、酸化的リン酸化速度と相関している。 これにより、解糖系代謝の初期段階であるGlcリン酸化と、ミトコンドリア内での酸化的段階（トリカルボン酸サイクル、それに伴う電子輸送と酸化的リン酸化：太線の矢印）が連携し、有害な乳酸の蓄積を回避していることが示唆される。
酸化的リン酸化によって基質特異性（ミトコンドリア内とミトコンドリア外のATP）の著しい変化がどのように引き起こされるかは不明ですが、ミトコンドリアに結合した酵素の構造がミトコンドリア膜電位やその他のミトコンドリア機能に関する要因に影響を受けることは明らかです。 このオルガネラの内膜（膜電位が存在する）と外膜（ヘキソキナーゼが結合している）の間の密接な相互作用を示す(Hashimoto and Wilson, 2000)。基質であるATPとの結合に関わる分子の領域が変化することで、基質特異性が変化すると以前から考えられていた(de Cerquiera and Wilson,1998)。