Abstract

ラットの脳内行動およびタンパク質と脂質の酸化損傷に対するモダフィニル（MD）の影響を評価した。 Wistarラットに水またはMD（75，150，300 mg/kg）をガベージにより単回投与した。 投与1，2，3時間後にopen-field装置で行動パラメータを評価した。 脳内ではチオバルビツール酸反応物質（TBARS）およびタンパク質カルボニル生成量を測定した。 MDは最高用量で投与1時間後および3時間後に運動活性を増加させた。 300 mg/kgのMD投与により，投与1時間後にオープンフィールド中央への訪問回数が増加したが，投与3時間後にはすべての投与量でオープンフィールド中央への訪問回数が増加した． MD 300 mg/kg は扁桃体、海馬および線条体の脂質障害を増加させた。 また、前頭前野、扁桃体、海馬の蛋白質障害を増加させたが、この効果は投与量により異なる。 一方、MD75および300 mg/kgの投与は線条体の蛋白質損傷を減少させた。 本研究により、MD 投与により行動変化が誘発され、その変化は投与量に依存することが明らかとなった。 また，MDの酸化損傷パラメータに対する効果は，特定の脳部位および投与量に依存することが示唆された． はじめに

モダフィニル（MD）は、ナルコレプシー、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、交代勤務睡眠障害などの睡眠の治療に頻繁に処方される非アンフェタミン作動性の精神活性薬である。 また、MD が作業記憶やエピソード記憶だけでなく、多くの認知領域の機能を高めることは、文献によく記載されています。 MDの記憶に対するこれらの効果は、精神科患者においても報告されており、本薬剤が精神疾患における認知機能障害の治療のための優れた候補薬剤であることが示唆されています . さらに、臨床研究では、MDが大うつ病、双極性障害、統合失調症、注意欠陥/多動性障害（ADHD）の患者の症状を改善することが示されている。

MDの作用機構は十分に理解されていないが、この薬剤が脳内のカテコールアミン、セロトニン、グルタミン酸、ガンマアミノ酪酸、オレキシン、ヒスタミン系に重要な作用を持つことが知られている . さらに、MDはドーパミントランスポーターを阻害し、警戒回路におけるドーパミン神経伝達を増加させることが研究で示されている . アンフェタミンなどの精神刺激剤は、様々な神経伝達系に作用し、恐怖、不安、多動などの行動に顕著な影響を与えることが分かっています . しかし、MDは従来の覚せい剤に比べて、多動、不安、ジタバタ感、リバウンド効果などの副作用との関連性が低い。

いくつかの研究では、精神刺激剤の投与がラットの脳の酸化ストレスにつながることが示唆された。 脳は体内酸素の20%を代謝し、抗酸化力が限られているため、特に活性酸素の産生に脆弱である . メチルフェニデート、m-アンフェタミン、d-アンフェタミンなどの精神刺激剤をラットに慢性投与すると、スーパーオキシド産生の増加、タンパク質、脂質、DNAの酸化損傷、酵素抗酸化物質およびミトコンドリア呼吸鎖複合体の変化が誘発された。

そこで本研究では、ラットの海馬、前頭前野、扁桃体、線条体の行動と酸化ストレスパラメータに対するMDの効果を評価することを目的とした。 実験方法

2.1. 動物

対象は、当社の飼育コロニーから入手したWistar系成熟雄ラット（体重250-350g）である。 動物はケージに5匹として収容し、餌と水を自由に摂取できるようにし、12時間の明暗サイクル（午前7時に点灯）で、温度は℃に維持した。 すべての実験手順は、Universidade do Extremo Sul Catarinenseの動物使用における現地倫理委員会の承認に従って実施された。 すべての実験は、概日リズムの変化を避けるため、一日のうち同じ時刻に行った

2.2. Drugs and Pharmacological Procedures

MD (Libbs Farmacêutica Ltda)をビヒクル-ビヒクル中に懸濁させた。 1%メチルセルロースを水に溶かしたもの。 溶液は使用直前に調製し、実験セッション中は遮光した。 懸濁液は注入期間中、常に撹拌されていた。 対照群にはビヒクルを投与した

2.3. 実験デザイン

この実験に使用したラットの総数は40匹である(1群あたり動物)。 動物は、1mL/kgの体積のMD(75、100、または300mg/kg体重)の単回投与を、経口投与で受けた。 対照群には1 mL/kgのビヒクルを投与した。 投与後1,2,3時間後に運動活性を測定し、オープンフィールド課題の直後に断頭してラットを殺した。 2.4.運動活性

運動活性は、前述したようにオープンフィールド課題を用いて評価した。 この課題は高さ50cmの壁で囲まれた40×60cmのオープンフィールドで行われ、茶色の合板で作られ、床は黒い線で9等分の正方形に区切られていた。 動物は左後方の四角形に静かに置かれ、5分間自由にアリーナを探索させた。 オープンフィールド試験では、以下の行動パラメータを評価した。

横断（運動活性／水平活性）：試験期間中にラットが横断したマスの総数を数えた。

背面（探索活性／垂直活性）：試験期間中にラットが立てた姿勢の総数を数えた。

オープンフィールド中心への訪問：オープンフィールドの中心への訪問回数の総数を数えた。 中央の正方形1cmをフィールドの「中央」領域と定義した。 酸化損傷マーカーの測定＜855＞＜1024＞ラットに上記のようにMDまたは水を投与し、最後の注射の3時間後に断頭で殺し、脳を取り出して解剖し、前頭前野、扁桃体、海馬および線条体の酸化損傷レベルを評価した。 TBARSとタンパク質カルボニル形成は、以前に記述したように測定された.

2.6. Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS)

酸加熱反応中のTBARSの生成は、過酸化脂質の測定に敏感な方法として広く採用されている活性酸素生成のインデックスとして、既述のように測定した. 簡単に説明すると、試料を1 mLのトリクロロ酢酸10% (TCA) と1 mLのチオバルビツール酸0.67% (TBA) と混合し、沸騰水浴中で15分間加熱した。 TBARSは535 nmの吸光度により測定した。 結果はMDA（マロンジアルデヒド）当量（nmol/mg protein）として表した。

2.7. タンパク質カルボニルの測定

タンパク質の酸化的損傷は、ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）との反応に基づくカルボニル基の測定により、以前に記述したように評価した 。 タンパク質を20%トリクロロ酢酸で沈殿させ、DNPHに溶解し、370 nmで吸光度を測定した。 統計解析

すべての解析は、statistical package for social sciences version 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)を用いて行った。 すべてのデータは平均値±SEMで示した。 行動分析における群間の差は、時間反応曲線にアクセスするための反復測定分散分析を用いて検証し、その後、Tukeyのポストホックテストを行った。 生化学的分析における群間の差異を検証するために、ANOVAを使用し、次いでTukeyのポストホックテストを使用した。 すべての実験において、値< 0.05は統計的な有意性を示すとみなした。 結果

3.1. 行動解析

運動量（横断）の解析（図1（a））では、反復測定分散分析により、MD投与（F（3.35） = 7.91, ）と行動反復（F（2.7） = 54.82, ）で有意差が認められた。 さらにTukey’s post hoc testによる解析の結果、MD 300 mg/kgは投与1時間後に対照群に比べラットの自発運動量を増加させることが明らかとなった。 また、対照群、MD 75 mg/kg、MD 150 mg/kgでは、3時間後に野外に再投与した際に横断回数が減少し、環境への馴化が示唆された。 しかし、MD 300 mg/kg 投与群では、2 時間後および 3 時間後にオープンフィールドに再投与した場合、横断回数が減少した。 この差は、300 mg/kgのMD投与後1時間で誘発された運動過多によって説明できるかもしれない。

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

探索（リアリング）の分析（図1（b））では、反復測定分散法により、行動反復に有意差が認められた（F（2.7） = 32.7, )。 Tukey’s post hoc testによる解析の結果、コントロール群、75 mg/kgのMD、150 mg/kgのMDは3時間後のオープンフィールドへの再暴露時にリアリングの回数が減少することが示された。

オープンフィールド中央への訪問回数の解析（図1（c））では、反復測定分散分析の結果、MD投与により有意差が認められた（F(3.34)=15.70、)。 さらにTukeyのポストホック検定を用いた解析の結果、300 mg/kgのMDは投与1時間後にコントロールと比較してオープンフィールドの中央への訪問回数を増加させた。 また、すべての投与量において、MDは投与3時間後にopen-fieldの中央への訪問を増加させた。 生化学的解析

図2（a）に示すように、MDを300mg/kg投与したラットの扁桃体（F（3）=4.18、）、海馬（F（3）=44.9、）、線条体（F（3）=7.07、）でTBARSレベルがコントロールグループと比較して有意に増加した。

(a)

(b)

(a)
(b)

(a)

(a)

図2

前頭前野のTBARS（a）またはプロテインカルボニル（b）レベルに対するMD投与または水（対照群）の効果。 ラットの扁桃体、海馬、線条体。 図2（b）で観察できるように、カルボニル生成の有意な増加は、300mg/kgの用量の前頭前野（F（3）＝29.9、）および75mg/kgの扁桃体（F（3）＝9.74、）および海馬（F（3）＝17.99、）においてMD投与後検出された。 逆に75 mg/kgと300 mg/kgのMD投与は対照群に比べ線条体のカルボニル生成を有意に抑制した（F（3）=21.93、）。 議論

本研究では、高用量（300 mg/kg）のMD単独注射によりラットに過運動を誘発し、投与後2時間と3時間ではそれが残存しないことが確認された。 我々の結果によると、MDはアカゲザルの運動活性を有意に増加させ、線条体の細胞外ドーパミン濃度を増加させた . Youngらは、MDがC57BL/6Jおよび129/SJマウスにおいて、活動性、レアリング、および運動経路の滑らかさを増加させることを示した。 これらのMDによる行動の変化は、シナプスのドーパミンの増加と、ドーパミンdrd1およびdrd4受容体を介した二次的作用に関連していた。 上記の研究とは異なり、傾向は見られるものの、MD投与後の探索行動の有意な増加は観察されなかった。 この相違は、方法論、種、投与時間の違いによって説明できる。

ここで、コントロール群と低用量（75、150mg/kg）のMDは、3時間後にオープンフィールドに再曝露させると横断とリアリング数が減少し、環境への慣れを示すことが確認された。 高用量（300 mg/kg）のMDは、2時間後および3時間後に野外に再投与すると、交差および後ずさりの回数を減少させることがわかった。 この矛盾は、MD（300 mg/kg）投与後1時間で横断回数が有意に増加し、後方移動回数が増加する傾向があることで説明できる。 新規環境に対する慣れは、非関連性学習の最も基本的な形態の一つと考えられている。 本研究で得られた興味深い知見は、MDが不安関連行動を調節することであった。 オープンフィールドテストでは、MD投与ラットはコントロールよりも不安感が少なく、回避中心域を探索する傾向さえ見られた。 また、300 mg/kgのMDは、投与1時間後にオープンフィールドの中央部へ行く回数を増加させた。 さらに、すべての投与量において、MDは投与3時間後にオープンフィールドの中央への訪問回数を増加させた。 文献上では、MDの不安に対する効果については、研究が論争になっている。 前臨床試験では、モダフィニルの不安に対する効果はない、または抗不安作用があることが示されている。 同様に、臨床研究におけるMDは、不安に対する抗不安作用または無作用を示す一方で、不安誘発作用を示すものもある 。 この研究間の違いは、使用された用量（100mg、200mg、400mg）および投与スケジュール（1回投与と1週間以上の慢性投与）の違いによって説明することができる。 MDの抗不安様作用は、脅迫的刺激に対する不安に関与する脳領域である扁桃体への作用によって説明することができる。 以前の研究では、MDは恐怖刺激に対する扁桃体の反応性を低下させることが示された 。 扁桃体にはカテコールアミンとセロトニンの投射が多いことが知られており、おそらくMDはノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニン、GABA系の変化あるいはこれらの作用の組み合わせによる扁桃体内シグナルの変化によって扁桃体の反応性を低下させると考えられる

行動変化の誘発に加えて、精神刺激剤が動物モデルおよびヒトで酸化的障害を引き起こすことが文献でよく述べられている … その結果、MDはラットの脳内の脂質やタンパク質の酸化的損傷を増加させることがわかった。 高用量（300 mg/kg）のMDを投与したラットの扁桃体、海馬、線条体でTBARSレベルが増加した。 また、MD 投与後のカルボニル生成量は、300 mg/kg 投与では前頭前野で、75 mg/kg 投与では扁桃体と海馬で増加が観察された。 MD はドーパミントランスポーターを阻害し、ドーパミンの神経伝達を増加させることが研究により示されている。 MDによる細胞外ドーパミン濃度の増加は、ラットの脳内のタンパク質と脂質の酸化的損傷につながるドーパミン酸化の毒性代謝物の過剰生産を誘発することができます。 文献上、MD投与後の脳損傷を評価した研究はないが、覚醒剤、記憶増強剤、抗疲労剤などのMDの健康人への利用が増加していることから、これらの研究は非常に重要である

逆に、MD（75および300 mg/kg）投与は対照群と比較して線条体のカルボニル生成を減少させた。 いくつかの研究では、MDの線条体神経保護能が示されている。 以前の研究では、パーキンソン病の動物モデルにおいて、MD治療後、線条体の1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine中毒のドーパミン作動性ニューロンの生存率が改善することを示した。 Raineri と同僚は、MD 投与がマウスの線条体におけるメタンフェタミン誘発神経毒性を減弱することを示し、この脳領域における MD の保護的役割の可能性を示唆している。 MDはメタンフェタミン依存症患者の学習を改善することが示されている 。 本結果は、MD投与が線条体において抗酸化作用を示す可能性を示唆しているが、MDの線条体に対する保護作用はまだ不明である。 線条体は、大脳皮質および視床からのグルタミン酸作動性入力と、中脳からのドーパミン作動性求心性入力とを統合する。 ドーパミンのシグナルは線条体の依存性学習や中棘突起ニューロンのシナプス可塑性に卓越した役割を演じている。 Rossatoらは、D1受容体作動薬の注入により、脳由来神経栄養因子（BDNF）レベルが上昇し、その結果、シナプス可塑性が増大することを示した。 このことから、MDはドーパミン系を活性化することによりシナプス可塑性を促進し、線条体を酸化的障害から保護することが期待される。 (2)MDはラットにおいて抗不安作用を示し，オープンフィールドの中心部への訪問回数を増加させた。 (3) MDはラット脳において脂質および蛋白質の酸化的損傷を誘発したが、酸化的損傷は解析した脳部位および投与したMDの用量に依存した。 (4) 最後に、MDは線条体をタンパク質の酸化損傷から保護することができた。 結果の解釈には注意が必要である。 第一に、抗酸化防御は測定されなかった。これは、MDが酸化ストレスに与える影響を調べた最初の研究であるため、結果の解釈に役立った可能性があることを認めている。 しかし、第二に、MDは健康なラットに投与された。精神疾患の動物モデルにおけるMDの酸化的障害への影響は、異なる結果を示すかもしれない。

利益相反

著者は、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言する。

謝辞

神経科学研究所（ブラジル）は国立トランスレーショナル医学研究所（INCT-TM）のセンターの一つであり、サンタカタリーナ応用神経科学センター（NENASC）のメンバーの一つである。 本研究は、CNPq、FAPESC、Instituto Cérebro e Mente、およびUNESCからの助成金により実施されたものである。 João QuevedoはCNPq研究員、Roger B. Varela、Wilson R. Resende、Amanda V. SteckertはCAPES学生研究員、Samira S. ValvassoriはCNPq学生研究員

である。