プラスミド101：タンパク質の発現
分子生物学のセントラルドグマは、DNA→RNA→タンパク質である。 特定のタンパク質を合成するためには、まず DNA がメッセンジャー RNA (mRNA) に転写される必要があり、その後 mRNA はリボソームでタンパク質の一次構造を構成するポリペプチド鎖に翻訳されます。 その後、ほとんどのタンパク質は、タンパク質の折り畳み、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、アセチル化などの翻訳後修飾を受け、機能的で安定したタンパク質が作られる。 タンパク質の発現とは、このプロセスの第2段階、すなわちmRNAからタンパク質を合成し、翻訳後修飾を加えることを指します
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Researchers use various techniques to control protein expression for experimental, biotechnological, and medical applications. 研究者は、蛍光タンパク質でタグ付けすることにより、生体内のタンパク質を可視化して局在性を研究したり、タンパク質を精製してその構造、相互作用および機能を研究したりすることができます。 タンパク質はまた、分子生物学研究（たとえば、ポリメラーゼおよびその他の酵素を精製して DNA を操作するために使用する）、または医学（たとえば、インスリン）において使用するために精製することができます。 タンパク質の生産と精製に用いられる発現系には、いくつかの種類がある。 5532>
全体として、タンパク質発現の一般戦略は、選択した DNA テンプレートで細胞をトランスフェクトし、これらの細胞に目的のタンパク質を転写、翻訳、修正させることから構成されます。 修飾されたタンパク質は、溶解した細胞からタンパク質タグを使用して抽出し、さまざまな精製方法を使用して汚染物質から分離することができます。 どの発現系を使用するかは、いくつかの要因によって決まります。
- 発現させようとしているタンパク質
- 必要なタンパク質量
- ダウンストリーム アプリケーションの計画
このブログ記事では、システムを選択する前に心に留めておくべき利点や注意事項を含め、一般的な発現システムの一部をまとめます。
Mammalian expression systems
哺乳類細胞は、タンパク質が適切に機能するために複数の翻訳後修飾を必要とする哺乳類タンパク質の発現に理想的なシステムです。 哺乳類発現用に設計されたほとんどのDNA構築物は、トランスフェクション後の強固な発現のためにウイルスプロモーター（SV40、CMV、およびRSV）を利用しています。 哺乳類システムでは、一過性にタンパク質を発現させることも、安定した細胞株で発現させることも可能です。 トランスフェクションが成功すれば、どちらの方法でも高いタンパク質収量が得られます。
いくつかの哺乳類システムでは、構成的および誘導的プロモーターの使用により、タンパク質が発現するタイミングを制御することも可能である。 誘導性プロモーターは、所望のタンパク質産物が高濃度で細胞に毒性がある場合に非常に有用である。 5532>
昆虫発現システム
昆虫細胞もまた、正しい翻訳後修飾を施した複雑な真核性タンパク質の生産に使用することができる。 昆虫発現系には、バキュロウイルス感染昆虫細胞と非溶解昆虫細胞の2種類があります。
バキュロウイルス発現系は、高レベルの組換えタンパク質発現に非常に強力です。 大腸菌や酵母では生産できないような、非常に複雑なグリコシル化タンパク質の高発現が可能である。 バキュロウイルスシステムの唯一の問題は、感染した宿主細胞が最終的に溶解してしまうことである。 細胞の溶解によりタンパク質の生産は停止するが、昆虫細胞ゲノムに組み込まれた遺伝子を継続的に発現させることができる非溶解性昆虫細胞発現系（sf9、Sf21、Hi-5細胞）が存在する。 これらのタイプの昆虫発現系はいずれも、大量のタンパク質を生産するためにスケールアップすることが可能である。
細菌発現システム
大量のタンパク質を迅速かつ安価に生産したい場合、細菌宿主細胞はほぼ常にその答えとなります。 大腸菌は間違いなく、タンパク質発現に特化したいくつかの菌株を持つ、最も人気のある宿主の1つである。 目的のタンパク質をコードするDNAをプラスミド発現ベクターに挿入し、それを細菌細胞に形質転換させる。 形質転換された細胞は増殖し、目的のタンパク質を産生するように誘導され、溶解される。
細菌細胞で大量のタンパク質を生産するために使用できる一般的なDNAベクターがいくつかあります: 例えばpET、pRSET、ゲートウェイpDEST、およびpBADベクターなどです。 これらのベクターからのタンパク質の発現は、それぞれ異なるプロモーターによって制御されているため、各ベクターからの発現レベルは異なります。 全てのベクターの中で、T7 lacプロモーターの制御下にあり、ラクトースによって誘導されるpETが最も高いレベルのタンパク質発現を提供します。
その使いやすさにもかかわらず、バクテリアは通常、機能的なマルチドメインの哺乳類タンパク質を生産できないことに注意することが重要である。なぜなら、バクテリア細胞には適切な翻訳後修飾を加える機能がないためである。 さらに、バクテリアによって生産された多くのタンパク質は不溶性になり、過酷な試薬と忍耐なしでは抽出が困難な封入体を形成する。
植物発現システム
植物は、組み換えタンパク質の大量発現の安価でローテクな手段となる。 トウモロコシ、タバコ、イネ、サトウキビ、さらにはジャガイモの塊茎など、様々な種類の植物から多くの細胞がタンパク質発現に利用されている。
植物系は、複雑な翻訳後修飾の大部分を含む、哺乳類細胞発現系と同じ特徴および処理要件を多く共有している。 しかしながら、植物からの組換えタンパク質の抽出および精製は、植物組織自体が生化学的に複雑であるため、高価かつ時間がかかる場合がある。
これらの問題を回避するために、科学者たちは、植物の根から自然に分泌される生化学物質やタンパク質を利用しました。 組換えタンパク質に、自然に分泌される植物ペプチドをつけることで、目的のタンパク質の入手と精製を容易にする。 5532>
Yeast expression systems
Yeast は、大量の組換え真核生物タンパク質を生成するための優れた発現システムです。 酵母は多くの種がタンパク質発現に利用できるが、遺伝学や生化学のモデル生物として利用されていることから、S. cerevisiaeが最も信頼性が高く、頻繁に利用されている種である。
S.セレビシエを使用する場合、研究者はしばしばガラクトース誘導性プロモーター（GAL）の制御下に組換えタンパク質を配置する。 その他、リン酸誘導性のPHO5プロモーターや銅誘導性のCUP1プロモーターもよく使われる。 酵母細胞は明確な培地で培養され、発酵に容易に適応できるため、タンパク質の大規模かつ安定的な生産が可能です。
一般に、酵母の発現系は哺乳類細胞よりも簡単で安価であり、細菌系とは異なり複雑なタンパク質の改変が可能な場合が多い。 しかし、酵母細胞は細菌細胞よりも増殖速度が遅く、増殖条件を最適化する必要がある場合が多い。
無細胞発現システム
無細胞発現システムでは、転写および翻訳装置の精製されたコンポーネントを用いて、タンパク質がin vitroで組み立てられます。 これには、リボソーム、RNAポリメラーゼ、tRNA、リボヌクレオチド、アミノ酸などが含まれます。 無細胞発現系は、1回の反応で複数のタンパク質を迅速に組み立てるのに理想的である。 これらのシステムの主な利点は、下流の様々なアプリケーションで有用な標識または修飾アミノ酸を持つタンパク質を組み立てることができることである。
Alyssa D. Cecchetelli は、Addgene の科学者です。 彼女はノースイースタン大学で博士号を取得し、特に細胞シグナル伝達とコミュニケーションに興味を持っています。
Additional Resources
- Thermofisher Protein Expression Systems
- Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges
- Production of recombinant proteins in plant root exudates
Tharman Protein Extression Systems