非遺伝性疾患に対する遺伝子治療

慢性臓器障害に関わるメカニズムの解明が進み、遺伝子治療研究への道筋が開かれました。 遺伝性疾患に対する遺伝子治療の開発は、過去数十年にわたり多くの前臨床・臨床研究が行われてきたが、動物モデルを用いた前臨床研究はいくつかあるものの、非遺伝性疾患に対する遺伝子治療の治療効果を検討する臨床試験はほとんど行われていないのが現状である。 最近の研究では、AAV9ベクターを用いたテロメラーゼの発現が、肺線維症モデルマウスにおいて治療効果を発揮することが示されました。 この治療法は特発性肺線維症を対象としたものです。 テロメアは染色体末端の保護構造として機能することが知られており、短いテロメアの存在が疾患発症の原因の一つであることが示されています。 この状態では、テロメアが短くなりすぎて、細胞分裂が停止し、細胞のアポトーシスが引き起こされます。 テロメラーゼはテロメアの長さを再構築する酵素であり、PovedanoらはAAV血清型9を用いてテロメラーゼを送り込み、短いテロメアを修正する治療法を開発した。 AAV9は再生肺胞II型細胞（ATII）を優先的に標的にするため、AAV9-Tertを投与したマウスは、ベクター投与後1-3週間で炎症と線維化が抑えられ、肺機能が改善されたことが確認された。 遺伝子治療8週目には、肺線維化が改善または消失したことは興味深い。 AAV9-Tert処理により、テロメアが長くなり、ATII細胞の増殖が増加し、DNA損傷、アポトーシス、老化が減少しました。 心不全に対するAAV遺伝子治療は、動物モデルを用いた前臨床試験で検証されており、これらのアプローチの大部分は、心筋細胞によるカルシウム処理を改善するために実施されている。 これらの研究の大部分は、筋小胞体カルシウムATPase（SERCA2a）という治療用タンパク質が使用されています。 前臨床試験で得られた良好な結果をもとに、最初の臨床試験（CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422）が実施され、AAV血清型1ベクターを用いてSERCA2aが進行した心不全患者の治療に使用されました。 この第1相試験の結果は、有害事象もなく成功し、第2相試験へと進み、有害事象の発生率も著しく低く、有望な結果を得ることができました。 しかし、同じベクターを用いた第 2b 相臨床試験（CUPID2b 試験、NCT01643330）の結果は、治療群とプラセボ群の間に有意な変化が見られず、残念な結果となった。 興味深いことに、AAV9ベクターでS100A1を、AAV2とAAV8血清型のキメラキャプシドでプロテインホスファターゼ1阻害剤の構成的活性型であるI1cを送達することを目的とした2つの新しい臨床試験が予定されている。 さらに、AAV1、AAV6、AAV9は心臓の遺伝子導入に最も有望なAAV血清型として浮上しており、将来的に心不全の治療に対する遺伝子治療アプローチの成功が期待されている。 Fischerらは、Ca2+チャネル結合ドメイン3（CBD3）遺伝子を発現するrAAVの投与により、炎症性および神経障害性疼痛モデル動物において、ピンで触れた後の痛覚過敏やアセトン刺激に対する感受性といった疼痛行動が有意に減少することを示した。 また、急性痛の重要な標的遺伝子であるバニロイド受容体1（TRPV1）に対するショートヘアピンRNA（shRNA）をコードしたAAV9ベクターを用いた研究では、予備神経損傷（SNI）モデルマウスにおいて治療後10-28日目に神経損傷による熱アレルギー（ニューロンの反応増加）を減弱することが実証されました …。 これらの結果は、慢性／糖尿病性神経障害性疼痛患者に対するAAVベクターベースの治療法を開発することを、遺伝子治療研究者に奨励するポジティブなエビデンスとなります。 アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤やアンジオテンシン受容体拮抗剤（ARB）は、高血圧患者の治療薬として広く使用されていますが、慢性肝疾患患者でも試用されたことがありますが、主に全身性の副作用を生じるため、その結果は納得できるものではありませんでした。 慢性肝線維症や肝硬変による末期肝疾患の患者さんでは、治療法がないため、必然的に肝移植が唯一の選択肢となっています。 さらに、慢性肝疾患の増加、ドナー臓器の不足、移植後の合併症、肝移植における高コストなどの理由から、肝線維症/肝硬変に対する特異的で有効、安全かつ安価な新規治療法の発見と処方が大きなニーズとなっています。 私たちの研究室では、レニン-アンジオテンシン系（RAS）の「代替軸」を標的として、その主要酵素であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）が、強力な線維化性オクタペプチドであるアンジオテンシンII（ANG II）を抗線維化性ヘプタペプチドであるアンジオテンシン（1-7）へと分解していると考え、その可能性が示唆されたのです。 動物実験から、遺伝子組換えヒトACE2（rhACE2）は、心血管疾患の高血圧予防や糖尿病性腎症の腎機能改善に有効であることが示されました。 興味深いことに、rhACE2は、第1相臨床試験において、健康なヒトのボランティアグループによる忍容性が高く、心血管系の好ましくない副作用を示すことはありませんでした。 また、胆汁うっ滞や四塩化炭素注射による肝損傷を誘発した実験的肝線維症に対する遺伝子組換えACE2の治療効果を報告した研究がある。 その結果、いずれの肝疾患モデルにおいても、リコンビナントACE2が肝線維化を有意に抑制することが明らかになった。 しかし、このような全身的なアプローチの大きな欠点は、治療が必然的にオフターゲット効果をもたらすことであり、多くの場合、それは望ましいことではない。 このように、リコンビナントACE2の全身投与にはいくつかの欠点がある。 これは、ACE2の毎日の注射を含む、臨床環境では侵襲的で高価な手順であり、血圧調節に好ましくない影響を及ぼすアプローチである 。 この問題を回避するためには、標的臓器の組織特異的なACE2レベルを増加させることが理想的なアプローチであろう。 肝臓特異的な組換えAAVベクターを用いた臓器特異的なACE2活性の増加は、標的臓器に限定した治療効果をもたらすと同時に、不要な標的外効果を最小限に抑えることが期待される。 私たちの研究室が発表した研究では、前臨床評価に擬似肝臓特異的AAVベクター（rAAV2/8）を用い、マウスに投与したマウスACE2遺伝子の肝臓過剰発現が、単回腹腔内注射後6ヶ月まで持続することを明らかにしました . 次に、胆管結紮（BDL）による胆道線維化、四塩化炭素（CCl4）注射による毒性障害、メチオニン・コリン欠乏（MCD）食による脂肪肝関連肝線維化などの肝疾患モデルマウスに、rAAV2/8-ACE2を単回腹腔内投与し、治療した。 この治療により、ACE2の発現とタンパク質活性が大きく上昇し、他の主要な臓器に影響を与えることなく肝臓に限局されました。 遺伝性疾患、例えば血友病Bでは、肝臓での比較的低いレベルの導入遺伝子の発現が、その後の血中FIXレベルのわずかな上昇に十分であるかもしれないが、非遺伝性疾患における治療介入に必要な導入遺伝子の発現の大きさは、大幅に大きくなる可能性がある。 このことは、遺伝子治療研究者にとっての課題でもある。 しかし、興味深いことに、rAAV2/8-ACE2による肝臓を標的とした治療法では、肝臓のACE2発現が増加することで、ヒト血清アルブミンを搭載した対照ベクター（rAAV2/8-HSA）を投与した場合と比較して、肝臓のプロフィブロティックAng IIレベルが50％以上減少することが見出された。 また、AngⅡの減少に伴い、抗線維化作用のあるAng-(1-7)ペプチドが増加し、炎症性サイトカインの発現が著しく低下し、3モデル全てで肝線維化が大幅に抑制されました（図2）。 これらの短期動物モデルを用いた研究はさらに検証され、胆道線維症や脂肪性肝疾患の長期動物モデル（これらの疾患を持つ患者に見られる肝病変とより類似した肝病変を生じる）において、rAAV2/8-ACE2の単回腹腔内注射が肝繊維化を著しく減少させることを示す証拠を提供しています（図3）。 AAVベクターを用いた他の研究とは対照的に、rAAV2/8-ACE2は対照ベクター（rAAV2/8-HSA）を投与した動物に比べ、疾患動物の血清アラニントランスアミナーゼ（ALT）値を低下させたことから、ベクター自体が肝臓で安全であることが示唆されました。 また、健康なマウスにrAAV2/8-HSA（10日まで）またはrAAV2/8-ACE2（24週間まで）ベクターを投与しても、血漿中ALT値に変化はなく、ベクター自体が肝臓障害を引き起こす可能性がないことが確認されました。 図4に、肝線維化におけるrAAV2/8ベクターを用いたACE2遺伝子治療の分子機構を模式的に示す（

rAAV2/8 ベクターを用いた肝臓を標的とした遺伝子導入は、成人の肝臓では治療上有望であることが示されているが、未熟な肝臓ではその効果は広く研究されていない。 rAAV2/8は新生児マウスの肝臓に高い効率で導入されるが、肝臓でのベクターの持続性はなく、肝臓の成長とともに急速に減少する 。 したがって、幼少期の肝疾患を治療するためにrAAV2/8を介した治療を成功させるには、再投与が必要かもしれません。 これと同様に、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損の新生児マウスにAAV2/8-OTC療法を行っても、成人期に高アンモニア血症からマウスを保護できないことが別の研究で証明されている . このように、肝臓特異的rAAV2/8遺伝子治療では、発達中の肝臓で安定した形質導入を行うことが最大の課題であり、新生児期の早期治療後に成体になっても治療効果を維持するには、ベクターの再投与が必要かもしれない。

前臨床試験に用いたAAVベクターはヒト肝臓で有効かもしれないが、導入効率が高いヒト肝細胞に特化したAAVベクターを選択することが重要である … 最近、2つのグループが肝臓指向性遺伝子治療に最適なrAAV血清型を同定するために、免疫抑制FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-) マウスモデルのようなヒト化マウスを使うことを提案しています。 25%以上のヒト肝細胞を再増殖したヒト化マウスモデルでの研究により、研究者はカプシドDNAシャッフルAAVライブラリに由来するLK-03などのヒト肝臓特異的AAVベクターを同定することができました。 このライブラリーは、10種類のAAVキャプシド遺伝子を用いて作成された。 5種類の親型AAVキャプシドからなるLK-03は、AAV血清型8と比較して、in vitroおよびin vivoの肝細胞癌異種移植モデルでより高い効率でヒト初代肝細胞を形質転換することができた。 また、Wangらはアカゲザル由来のクレードE AAVであるAAVrh10のキャプシドとAAV3Bを用いたFRGマウスの肝移植レベルが高いことを報告し、AAV-LK-03ベクターがAAV3BやAAV8よりも優れている可能性を示している 。 今後、肝疾患以外の疾患においても、ヒト化動物モデルの利用が進み、AAVベクターの新規変異、導入効率、ヒト組織に特異的な免疫反応などを明らかにすることが期待されます。 さらに、非ヒト霊長類の肝臓に肝臓特異的に強固なGFP発現を起こさせることができたAAV3B-eGFPベクターは、AAV8よりも明らかに肝毒性がないことが報告されている .

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