Utilità dell’acido organico prodotto da Exiguobacterium sp. 12/1 sulla neutralizzazione delle acque reflue alcaline
Abstract
Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare il ruolo degli acidi organici prodotti dal ceppo 12/1 di Exiguobacterium sp. (DSM 21148) nella neutralizzazione delle acque reflue alcaline provenienti dall’industria delle bevande. Questo batterio è noto per essere in grado di crescere in mezzi con pH fino a 12,0 e di neutralizzare le acque reflue industriali alcaline da pH 12,0 a pH 7,5. L’indagine iniziale sul tipo di gruppi funzionali presenti nel mezzo, effettuata utilizzando la spettroscopia FT-IR, ha rivelato la presenza di picchi corrispondenti al gruppo carbonile e al gruppo idrossile, suggerendo il rilascio di acido carbossilico o di prodotti metabolici correlati. L’identificazione del gruppo carbossilico specifico, effettuata utilizzando RP-HPLC, ha rivelato la presenza di un singolo picco nel surnatante della coltura con tempo di ritenzione più simile all’acido formico. La concentrazione di acido prodotto su diverse fonti di carbonio è stata studiata in funzione del tempo. Anche se l’acido era presente nella stessa concentrazione finale, il tasso di produzione di acido era più alto nel caso del mezzo integrato con saccarosio seguito da fruttosio e glucosio. La conoscenza dei prodotti metabolici del batterio può essere considerata come un primo passo verso la realizzazione del suo potenziale per il biorisanamento su larga scala delle acque reflue alcaline dell’industria delle bevande.
1. Introduzione
Gli alcalifili – microrganismi che hanno optima di crescita a pH 9 o superiore – hanno avuto un grande impatto nelle applicazioni industriali. I detergenti biologici contengono enzimi, come le cellulasi alcaline e/o le proteasi alcaline, che sono state prodotte dagli alcalifili. Gli alcalifili sono stati utilizzati anche per la produzione industriale di enzimi che potrebbero essere di uso specifico, per esempio la ciclodestrina tramite la glucanotransferasi alcalina ciclomaltodestrina e l’α-amilasi alcalina attiva che forma il maltosio e che trova applicazione nelle industrie alimentari, chimiche e farmaceutiche. È stato riportato che la pasta di legno trattata con alcali potrebbe essere sbiancata biologicamente dalle xilanasi prodotte dagli alcalifili. Fujiwara e colleghi hanno riportato l’uso di una proteasi alcalina per decomporre il rivestimento gelatinoso delle pellicole a raggi X, da cui è stato recuperato l’argento. Gli alcalifili hanno anche dimostrato il loro potenziale nella biodegradazione di una varietà di composti organici.
Quindi, i batteri alcalifili hanno attirato molto interesse a causa dei loro enzimi extracellulari e proprietà biochimiche come l’alcalinità e la stabilità agli alcali. La loro bioenergetica è stata anche studiata in qualche dettaglio, mentre poco si sa sulla loro fisiologia, per esempio, gli enzimi intracellulari e i metaboliti. Le caratteristiche del processo metabolico intermedio sono importanti poiché aiutano a caratterizzare il batterio, la sua composizione enzimatica, lo stadio metabolico delle cellule e le possibilità di ingegneria metabolica. La capacità degli alcalifili di fluttuare fortemente il pH del mezzo contenente carboidrati è stata sfruttata in un lavoro precedente per la neutralizzazione delle acque reflue altamente alcaline provenienti dall’industria delle bevande utilizzando Exiguobacterium sp. ceppo 12/1 . Il genere Exiguobacterium appartiene all’ordine Bacillales che comprende anche membri del genere Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 è un alcalifilo facoltativo che cresce in modo ottimale a pH 10 ed è in grado di neutralizzare le acque reflue alcaline per portarle da pH 12,0 a pH 7,5. Si presume che il batterio rilasci qualche prodotto metabolico acido per neutralizzare il mezzo esterno altamente alcalino. Tuttavia, è importante caratterizzare il tipo di metaboliti rilasciati nel mezzo extracellulare. Qui, studiamo la produzione di acidi organici come un possibile meccanismo di neutralizzazione degli alcali. Questi tipi di studi saranno necessari prima che le applicazioni su larga scala del batterio per la neutralizzazione delle acque reflue alcaline dell’industria delle bevande possano essere sviluppate.
La principale fonte di carbonio nelle acque reflue dell’industria delle bibite è il saccarosio (disaccaride contenente glucosio e fruttosio) che è anche il maggior contributore alla sua domanda biochimica di ossigeno (BOD). Il BOD medio delle acque reflue dell’industria delle bevande analcoliche varia da 600 a 4500 mg/L che è equivalente a 673-5052 ppm di saccarosio. Un’indagine della letteratura sui prodotti metabolici di un gran numero di batteri che crescono su zuccheri semplici suggerisce che i batteri potrebbero utilizzare questi zuccheri semplici per generare acidi organici. Questo è ulteriormente confermato dall’analisi dei prodotti metabolici extracellulari di altre specie di Bacillus alcalifili. Il principale acido organico prodotto sulla fonte di carbonio saccarosio in questi studi è risultato essere l’acido acetico. L’acido formico è un metabolita comune dei batteri neutrofili in condizioni anaerobiche, mentre B. circulans var. alkalophilus ne produce fino a 2 g/L anche in culture aerobiche. Altri acidi volatili come l’acido propionico, butirrico, isobutirrico e isovalerico sono tipici dei ceppi Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus e Bacillus sp. 17-1. Gli acidi isobutirrici e isovalerici sono stati riportati nei media di diversi bacilli neutrofili. Ma questi acidi, così come gli acidi propionico e butirrico, sono considerati originati dagli aminoacidi sulla base di studi su Clostridium sp. Gli acidi lattico e piruvico sono abbastanza comunemente prodotti da bacilli neutrofili, ma la produzione di acido succinico da Bacillus è rara. L’etanolo non è stato rilevato nei bacilli alcalini anche se è un prodotto tipico delle colture di glucosio di molti bacilli neutrofili. Quindi le condizioni di crescita alcalina possono influenzare la produzione dei metaboliti neutri. In questo studio abbiamo utilizzato la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa per studiare il tipo e la concentrazione di acidi prodotti dal ceppo 12/1 di Exiguobacterium sp. durante la neutralizzazione di un mezzo a pH elevato contenente diversi tipi di fonti di carbonio. Ceppo e condizioni di coltura
La cultura Exiguobacterium sp. 12/1 è stata ottenuta da DSMZ (DSM 21148) ed è stata mantenuta come stock di glicerolo. Il terreno basale alcalino (ABM) contenente (tutte le concentrazioni in g/L): peptone, 1; estratto di lievito, 0.5; glucosio, 1; K2HPO4, 0.1; Na2CO3, 1; pH 10 (gli ultimi tre componenti aggiunti al terreno autoclavato da soluzioni sterilizzate separatamente) è stato utilizzato per la coltivazione di routine del ceppo 12/1 a 37°C. Per le analisi IR e RP-HPLC, il batterio è stato coltivato a 37°C, 200 rpm in terreno salino minimo (MSM) contenente (tutte le concentrazioni in mM): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA sale disodico, 0.3; ZnSO4-7H2O, 0.01; MnSO4, 0.02; CuSO4-5H2O, 0.004; FeSO4-7H2O, 0.1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 e 1% (w/v) di uno dei seguenti carboidrati: glucosio, fruttosio, o saccarosio (tutti i componenti aggiunti dalle soluzioni stock concentrate autoclavate separatamente). Il pH finale del mezzo è stato regolato a 10,5 usando 1 N NaOH.
2,2. Analisi della crescita e del pH della coltura
1 mL di coltura in fase log su ABM è stato usato per inoculare precolture (50 mL) (MSM contenente 1% di zucchero). La coltura di prova vera e propria (250 mL di MSM in una beuta da 500 mL) è stata inoculata con l’intera precultura in fase log a metà (O.D. ~ 1,2). Ogni set di coltura consisteva di tre beute. L’assorbanza dei campioni a 650 nm è stata usata come misura della crescita batterica. Il pH è stato determinato in campioni di colture senza cellule a temperatura ambiente dopo la centrifugazione 4000 ×g per 20 min.
2.3. Analisi FT-IR
La coltura è stata raccolta dopo 60 ore di crescita ed è stata centrifugata a 4000 ×g per 20 min. Per l’analisi IR, il surnatante della coltura è stato liofilizzato e ridotto in polvere. Il surnatante in polvere è stato poi mescolato con bromuro di potassio, e la miscela è stata pressata in compresse. Infine, la compressa è stata analizzata utilizzando lo spettrometro FT/IR-4200 (JASCO, Tokyo, Giappone).
2.4. Analisi RP-HPLC
La coltura è stata raccolta in diversi momenti ed è stata centrifugata a 4000 ×g per 20 min. Per l’analisi HPLC il surnatante della coltura è stato filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm e 10 μL di campione filtrato sono stati iniettati nella colonna HPLC.
Acido formico, acido acetico, acido succinico, acido propionico, acido lattico e acido isobutirrico di grado standard analitico sono stati ottenuti da Sigma. Sono state preparate soluzioni standard di riserva (100 mg/mL o 100 μL/mL) che sono state conservate a 4°C per ulteriori usi. Le soluzioni standard di lavoro (10 mg/mL o 10 μL/mL) sono state preparate ogni giorno. L’acqua Milli-Q (Millipore) è stata usata per preparare soluzioni tampone e stock di ogni composto e campioni. Le soluzioni stock, i campioni e il buffer sono stati filtrati attraverso filtri a membrana di cellulosa Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). I solventi sono stati degassati sotto vuoto prima dell’uso.
L’analisi degli acidi organici è stata fatta secondo il metodo di Tormo e Izco . L’analisi è stata effettuata su un sistema Breeze (Waters, Mildford, MA, USA) composto da una pompa HPLC binaria 1525, un campionatore automatico 717 plus e un rivelatore UV a due canali 2487 impostato a 210 nm, gestito utilizzando un software Breeze. La separazione è stata eseguita su una colonna Atlantis dC18 (Waters) 250 × 4.6 × 5 μm. 20 mM di NaH2PO4 aggiustato a pH 2.20 con acido fosforico è stato preparato quotidianamente e filtrato attraverso membrane idrofile da 0.2 μm (Millipore). Il programma solvente utilizzato due serbatoi contenenti 1% di acetonitrile in 20 mM tampone fosfato regolata a pH 2,20 con acido fosforico (solvente A) e acetonitrile (solvente B), la velocità di flusso è stato impostato a 1,5 mL/min a temperatura ambiente. Il programma di gradiente è iniziato con il 100% di solvente A e dopo 7 min il solvente B è stato aumentato linearmente per raggiungere il 7% in 5 min. Da 12 a 19 min il tasso è stato mantenuto al 93% del solvente A e al 7% del solvente B. Dopo di che il tasso è stato cambiato alle condizioni di partenza per equilibrare la colonna per 15 min prima di iniettare nuovamente 10 μL del campione successivo.
3. Risultati
3.1. Analisi della neutralizzazione su un mezzo definito
Per l’analisi dell’acido organico prodotto dal batterio è stato scelto un mezzo a sale minimo a causa della sua natura definita e della fonte di carbonio simile alle acque reflue dell’industria delle bevande. Il batterio è stato fatto crescere in un terreno salino minimo integrato con diverse fonti di carbonio: glucosio, fruttosio e saccarosio. La figura 1 mostra il profilo di crescita e le caratteristiche del pH del mezzo nel tempo. Il fruttosio e il saccarosio hanno prodotto una neutralizzazione molto più veloce del mezzo rispetto al glucosio. Il pH finale ottenuto con il glucosio era anche leggermente più alto di quello ottenuto nel caso del mezzo integrato con saccarosio e fruttosio. Questo si riflette anche nel profilo di crescita del batterio cresciuto sulle tre fonti di carbonio. I batteri sono cresciuti più rapidamente nel saccarosio seguito dal fruttosio e dal glucosio.
(a)
(b)
(a)
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Variazione in pH (a) e O.D. (b) con il tempo su MSM. I valori rappresentano la media di tre misure replicate, e le barre di errore rappresentano la deviazione standard.
3.2. Identificazione del gruppo funzionale presente nel surnatante della cultura
Per identificare il gruppo funzionale ampio del metabolita prodotto dal batterio per neutralizzare l’acqua di scarico alcalina, il surnatante della cultura liofilizzato è stato sottoposto alla spettroscopia FT-IR. Due picchi corrispondenti al gruppo carbonile (a 1644,98 cm-1) e al gruppo idrossile (a 3436,74 cm-1) erano presenti nello spettro (Tabella 1). Secondo l’indagine della letteratura, il batterio molto probabilmente produce acidi organici come prodotto metabolico che neutralizza le acque reflue alcaline.
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3.3. Identificazione del prodotto metabolico specifico del batterio
Al fine di identificare l’acido organico prodotto dal batterio, l’HPLC in fase inversa è stato eseguito utilizzando standard di acidi organici noti selezionati dopo un’indagine della letteratura. Gli standard sono stati eseguiti sia individualmente (Figura 2(a)) che in miscela (Figura 2(b)) al fine di accertare eventuali differenze nel tempo di ritenzione dovute all’interferenza di altri acidi organici nel mezzo. La RT degli acidi organici standard nei due casi è stata trovata simile con la differenza nel tempo di ritenzione non superiore a 0,09 unità tranne che per l’acido propionico (Tabella 2). Il surnatante della coltura è stato analizzato con lo stesso metodo ed è risultato comprendere un singolo picco con tempo di ritenzione simile all’acido formico. Questo è stato ulteriormente confermato da spiking il surnatante con acido formico standard il cui picco sovrapposto a quello del prodotto in surnatante (Figura 2 (d)).
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RP-Cromatogrammi HPLC di singoli acidi organici standard (a), acidi organici standard in miscela (b), surnatante di coltura (c), e surnatante di coltura con aggiunta di acido formico.
3.4. Analisi quantitativa del prodotto metabolico del batterio
Per l’analisi quantitativa del surnatante della coltura, sono state eseguite diverse concentrazioni standard di acido formico, ed è stata calcolata l’area del picco corrispondente ad ogni concentrazione. L’area del picco è stata tracciata contro la concentrazione per ottenere una curva standard (Figura 3). Questa curva standard è stata usata per calcolare la quantità di acido prodotto nel tempo su un terreno salino minimo integrato con diverse fonti di carbonio. Il surnatante della coltura del batterio è stato analizzato in modo dipendente dal tempo ed è stato nuovamente sottoposto ad analisi HPLC in fase inversa. È stato trovato che il picco del prodotto principale nel surnatante della coltura batterica aumenta con il tempo. Il tempo di ritenzione dell’acido è simile a quello dell’acido formico. Lo studio dell’acido formico prodotto con diverse fonti di carbonio in funzione del tempo è mostrato nella Figura 4. La più alta quantità di acido è stata prodotta nel caso di MSM integrato con saccarosio seguito da fruttosio e glucosio.
Curva standard per la determinazione della concentrazione di acido formico nel surnatante della cultura.
Variazione della quantità di acido organico prodotto nel tempo su MSM integrato con diverse fonti di carbonio. I valori rappresentano la media di tre misure replicate, e le barre di errore rappresentano la deviazione standard.
4. Discussione
La principale fonte di carbonio nell’effluente dell’industria delle bevande è il saccarosio. Pertanto, per l’analisi del prodotto metabolico prodotto durante la neutralizzazione, è stato selezionato un terreno salino minimo ben definito contenente saccarosio e i due monosaccaridi zuccheri costituenti – glucosio e fruttosio. Le caratteristiche di crescita del ceppo 12/1 su terreni salini minimi integrati con le tre fonti di carbonio mostrano un’efficiente neutralizzazione in concomitanza con la crescita (Figure 1(a) e 1(b)). La diminuzione del pH del mezzo di crescita è necessariamente dovuta o alla formazione di acidi o alla rimozione di basi.
La produzione di acidi è ben documentata nel caso di batteri coltivati su zuccheri semplici. I prodotti metabolici di alcuni membri alcalifili del genere Bacillus sono stati studiati. Il principale acido organico prodotto sulla fonte di carbonio saccarosio in questi studi è risultato essere l’acido acetico. Le sequenze del genoma delle specie di bacillo alcalifilo – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans e Bacillus clausii – supportano anche questa osservazione in quanto tutte queste specie hanno un percorso funzionale di conversione da piruvato ad acetato. L’acido formico è un metabolita comune dei batteri neutrofili in condizioni anaerobiche, mentre B. circulans var. alkalophilus ne produce fino a 2 g/L anche in culture aerobiche. Altri acidi volatili come l’acido propionico, butirrico, isobutirrico e isovalerico sono tipici dei ceppi Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus e Bacillus sp. 17-1. Gli acidi isobutirrici e isovalerici sono stati riportati nei media di diversi bacilli neutrofili. Ma questi acidi, così come gli acidi propionico e butirrico, sono considerati originati dagli aminoacidi sulla base di studi su Clostridium sp. Gli acidi lattico e piruvico sono abbastanza comunemente prodotti da bacilli neutrofili, ma la produzione di acido succinico da Bacillus è rara. L’etanolo non è stato rilevato nei bacilli alcalini anche se è un prodotto tipico delle colture di glucosio di molti bacilli neutrofili. Quindi le condizioni di crescita alcalina possono influenzare la produzione dei metaboliti neutri.
Gli studi iniziali sui prodotti metabolici nel caso di Bacillus sp. erano stati effettuati utilizzando la procedura titrimetrica. L’aumento della capacità tampone del surnatante della coltura batterica intorno al pH 5, che è il tipico intervallo di protonazione degli acidi carbossilici, è stato utilizzato per ipotizzare che il mezzo contenga acidi carbossilici. In questo studio, abbiamo usato la spettroscopia FT-IR per accertare il gruppo funzionale dei composti presenti nel surnatante della coltura. La spettrografia FT-IR ha mostrato i picchi caratteristici del gruppo carbonile (a 1644.98 nm) e del gruppo idrossile (a 3436.74 nm) (Tabella 1) che suggerisce la presenza di una specie chimica composta da un gruppo idrossile e carbonile ed è molto probabile che si tratti di acido carbossilico.
Il metodo HPLC in fase inversa è stato utilizzato per analizzare gli acidi organici presenti nel surnatante della coltura. Le condizioni HPLC sono state scelte per la migliore risoluzione riportata, cioè pH 2.2 e 1% di acetonitrile. Il metodo HPLC in fase inversa è vantaggioso per l’uso di colonne più economiche, una più facile manipolazione dei parametri analitici per ottimizzare la separazione e le analisi a temperatura ambiente. Il metodo è stato prima utilizzato per calcolare il tempo di ritenzione degli standard acidi scelti in base all’indagine della letteratura. L’ordine di eluizione degli acidi in queste condizioni era uguale a quello riportato in Tormo e Izco, ma c’era una variazione nei tempi di ritenzione osservati in questo studio e in quello riportato in Tormo e Izco. Questa variazione può essere attribuita alla differenza nelle condizioni HPLC come la temperatura 25-30 ° C in questo studio contro 24 ° C ± 1 ° C riportato in Tormo e Iczo.
La RP-HPLC del surnatante della coltura mostra la presenza di un singolo picco con assorbanza a 211 nm che è caratteristica lunghezza d’onda di assorbimento degli acidi organici. Quindi il surnatante contiene una singola specie chimica che è molto probabilmente un acido organico. Il confronto tra il tempo di ritenzione di questo picco e il tempo di ritenzione degli acidi organici standard mostra che il tempo di ritenzione è molto simile all’acido formico. Questa osservazione è stata ulteriormente confermata dall’aggiunta di acido formico nel surnatante della coltura che aumenta l’area del picco del prodotto (Figure 2(c) e 2(d)). La presenza di acido formico nel surnatante della coltura è in accordo con i prodotti metabolici di alcuni membri alcalifili del genere Bacillus così come alcuni batteri alcalifili anaerobi saccarolitici come Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum e Amphibacillus tropicus.
La massima diminuzione di unità di pH per unità di tempo riportata finora nei batteri alcalifili è di 0,13 unità all’ora nel caso di Bacillus circulans var. alkalophilus che è piuttosto bassa rispetto alla diminuzione di più di due unità durante 1 ora iniziale di inoculazione riportata in questo studio. La grande diminuzione del pH ha indicato la formazione di prodotti acidi del catabolismo. Tuttavia, il tasso di diminuzione del pH da solo non indica l’aumento della concentrazione di acidi. Pertanto, l’analisi quantitativa del prodotto metabolico del batterio è stata effettuata utilizzando RP-HPLC. L’HPLC è stato preferito al GC in quanto un confronto tra i metodi GC e HPLC per la determinazione degli acidi organici nei surnatanti di coltura dei batteri alcalofili suggerisce che mentre la risoluzione degli acidi con GLC era eccellente, la riproducibilità quantitativa con HPLC era migliore di GLC. Come previsto, la concentrazione di acido prodotto è stata trovata per aumentare con l’aumento del tempo di incubazione (Figura 4). Infatti, la quantità di acido ha continuato ad aumentare molto dopo il raggiungimento del pH minimo. Questo è in accordo con gli studi precedenti sulla produzione di acido nel caso di Bacillus sp. alcalifili facoltativi e obbligati, dove la produzione di acido ha continuato ad aumentare anche 30 ore dopo il raggiungimento del pH minimo. L’analisi comparativa del prodotto metabolico prodotto in mezzi integrati con diverse fonti di carbonio mostra che anche se l’acido era presente nella stessa concentrazione finale, il tasso di produzione di acido era più alto nel caso del mezzo integrato con saccarosio seguito da fruttosio e glucosio (Figura 4). Questo è in accordo con le caratteristiche di crescita dell’organismo nei mezzi integrati con questi zuccheri.
5. Conclusione
Exiguobacterium sp. ceppo 12/1 neutralizza il pH del mezzo esterno attraverso la produzione di acido organico a catena corta – acido formico. Tenendo in considerazione la potenziale applicazione del biorisanamento su larga scala delle acque reflue alcaline, questa capacità di neutralizzazione degli alcali del batterio per le acque reflue dell’industria delle bevande può essere considerata come un primo passo verso lo sfruttamento del suo potenziale di commercializzazione.
Riconoscimenti
N. M. Kulshreshtha riconosce la University Grants Commission per la borsa di ricerca. Gli autori sono immensamente grati al Council of Scientific and Industrial Research, India, per aver fornito una piattaforma di R&D e strutture per questa ricerca.