L’associazione di Escherichia coli verotoxigenici (VTEC) con la malattia umana risale a più di 30 anni fa. La comparsa di focolai dovuti a VTEC negli Stati Uniti nel 1982 ha focalizzato l’attenzione del mondo su questi patogeni. Dalla scoperta della verocitotossina, e dall’articolo di Karmali et al. sui casi di sindrome emolitico-uremica post-diarroica (D+HUS) causata da VTEC, altrimenti nota come Escherichia coli tossigena Shiga (STEC), si è accumulato un grande corpo di conoscenze, ma nonostante queste informazioni, il trattamento di successo di queste infezioni è rimasto sfuggente.

Fonti e patogenesi dell’infezione da VTEC

Fonti e diffusione di VTEC

La colonizzazione intestinale degli animali da fattoria, specialmente dei ruminanti come bovini, pecore e capre è la probabile origine di VTEC/STEC. Da queste fonti derivano una varietà di veicoli di trasmissione agli esseri umani, compresi molti cibi diversi di origine animale o vegetale, e l’acqua usata per nuotare e bere e per coltivare piante commestibili. Anche la contaminazione fecale umana del cibo e dei semi potrebbe giocare un ruolo, specialmente nei paesi in via di sviluppo.

Il potenziale di diffusione di VTEC è ulteriormente aggravato dalla globalizzazione del cibo, che presenta una grande opportunità per VTEC di diffondersi rapidamente in ampie fasce della popolazione. La distribuzione globale degli alimenti comporta un rischio intrinseco e presenta grandi difficoltà nel controllo degli agenti patogeni di origine alimentare e nell’identificazione delle fonti dei focolai, come è stato recentemente testimoniato in Europa. Questo è ulteriormente discusso nel commento di Werber et al.

Ceppi VTEC

Esistono vari ceppi di VTEC e, come discusso nel commento collegato, i cloni O157, sebbene meno prevalenti dei ceppi non-O157, tendono ad essere più virulenti. Così, anche se i ceppi VTEC non-O157 erano stati originariamente segnalati e continuavano ad essere segnalati, sebbene solo da microbiologi dedicati, la maggior parte dei ricercatori nel campo li ha ampiamente ignorati. Nessuna attenzione sembra essere stata data al fatto generalmente osservato che c’è una diversità diffusa di sierotipi di E. coli nell’intestino umano in qualsiasi momento e questo è stato trovato anche negli animali, specialmente nei bovini. La maggior parte delle feci dei ruminanti contiene una varietà di sierotipi VTEC, ma alcuni, come O157 e anche O111, anche se raramente presenti e solo in piccole quantità, sono particolarmente virulenti. È importante notare che un numero crescente di altri sierotipi può essere coinvolto e uno studio su un focolaio ha dimostrato che più sierotipi VTEC con cui un paziente è infettato, peggiore è la condizione clinica (anche se il sierotipo VTEC principale era O111). Mentre gli isolamenti di VTEC O111 dal bestiame sono rari, i ceppi non VTEC, che sono altrimenti indistinguibili dai ceppi VTEC, appaiono abbondanti, specialmente nelle feci del bestiame malato e dei pazienti.

Studi dettagliati hanno dimostrato che le tossine Shiga possono essere suddivise in una serie di sottotipi e che questi sono anche specifici dell’ospite. Esiste quindi una “doppia specificità dell’ospite” tra i ceppi VTEC. Alcuni cloni sono specifici per i bovini, mentre altri sono specifici per le pecore. I sottotipi di tossina che questi ceppi portano sono specifici per i tipi di VTEC trovati in questi ospiti mammiferi. Pertanto, non cercando la presenza di tutti i sierotipi VTEC durante un’epidemia, si perde una grande quantità di informazioni epidemiologiche e non si identifica l’animale di origine.

Patogenesi della sindrome emolitico-uremica post-diarroica

VTEC/STEC/ E. coli enteroemorragico (EHEC) appartengono a cloni di E. coli zoonotici di diversi sierogruppi O. Questi sierogruppi si sono evoluti e hanno acquisito specifici fattori di virulenza che permettono ai batteri di colonizzare e infettare il colon umano, di solito senza invasione del flusso sanguigno. Una volta ingeriti, STEC/VTEC/EHEC causano diarrea sanguinolenta (BD), colite grave e HUS. Questi batteri sono conosciuti come EHEC quando l’infezione è associata a gravi malattie coloniche e/o renali. La produzione di tossine Vero/Shiga è stata considerata la base della loro patogenicità, tuttavia, altre tossine come la citotossina subtilasi (SubAB) e la tossina distensiva citoletale e la proteasi secreta dell’inibitore dell’esterasi C1 di EHEC (StcE) probabilmente svolgono un ruolo.

La recente epidemia di E. coli O104:H4 di origine alimentare in Europa ha nuovamente attirato l’attenzione sulle infezioni da STEC o EHEC insieme alle loro devastanti complicazioni di insufficienza renale (tramite HUS), e ictus da coagulopatia intravascolare e vasculopatia o microangiopatia trombotica. L’insolita virulenza e letalità del ceppo O104:H4 è il risultato della commistione genetica di fattori di virulenza, comprese le proprietà enteroaggregative e la resistenza multipla agli antibiotici, ed è una lezione sull’evoluzione microbica e la plasticità genomica di E. coli. Il ceppo O104:H4 è ora noto come E. coli enteroaggregativo ed enteroemorragico (EAHEC).

Abbiamo recentemente osservato le proprietà combinate della capacità enteroaggregativa (fornendo un forte attaccamento tramite le fimbrie e la colonizzazione dell’epitelio colonico) con la produzione della tossina Shiga (Stx) nel nuovo e altamente letale ceppo europeo di E. coli O104:H4. Da allora è stato dimostrato che questo ceppo apparteneva a una stirpe di E. coli enteroaggregativa che aveva acquisito i geni per la tossina Shiga 2 e la resistenza agli antibiotici.

La patogenesi della malattia HUS rimane incompleta; notevolmente, durante la HUS la Stx del siero non è rilevabile. Sembra che i leucociti polimorfonucleati (PMN) siano attori chiave nella consegna di Stx a siti critici come i reni. L’entità del danno renale nei bambini con HUS associata a STEC può essere correlata alla concentrazione di Stx presente nei PMN circolanti. Paradossalmente, i pazienti con elevate quantità di Stx sul PMN hanno mostrato una funzione renale conservata o leggermente compromessa (forma incompleta di HUS), mentre i casi con basse quantità di PMN-Stx di solito presentano un’insufficienza renale acuta. Inoltre, elevate quantità di PMN-Stx inducono un ridotto rilascio di citochine da parte dell’endotelio renale, con congruente minor grado di infiammazione, mentre basse quantità di tossina PMN innescano una cascata di citochine, provocando infiammazione con conseguente danno tissutale. La microvasculatura gioca un ruolo importante nella patogenesi: La D+HUS è associata a trombi piastrinici nella microvasculatura di quasi tutti i letti vascolari. Il plasma dei pazienti HUS induce l’apoptosi delle cellule endoteliali microvascolari coltivate nella maggior parte degli organi. Due eventi chiave sono coinvolti nella patogenesi della D+HUS: alterata attività del fattore Von Willebrand (VWF) (per esempio, come si è visto con la carenza di “a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif-13” (ADAMTS13)) e attivazione site-specific e/o apoptosi delle cellule endoteliali microvascolari. Un deficit di ADAMTS13, che media l’elaborazione proteolitica dei multimeri VWF ultralarge proadesivi appena rilasciati dalle cellule endoteliali, si pensa abbia anche un ruolo nella coagulopatia D+HUS. Prendere di mira l’interruzione di questi processi dà speranza per potenziali nuove modalità di trattamento.

I patogeni intestinali batterici prendono di mira l’epitelio associato al follicolo che sovrasta le placche di Peyer. I microrganismi fanno breccia nella barriera intestinale attraverso le cellule M e vengono catturati dai macrofagi della mucosa. STEC/EHEC sono in grado di interagire in vivo con le placche di Peyer e di traslocare attraverso la mucosa. Dopo essere stati catturati dai macrofagi e dalle cellule M, i batteri producono Stx e inducono l’apoptosi di queste cellule ospiti e il rilascio di Stx. Queste interazioni microbo/cellula ospite potrebbero rappresentare nuovi bersagli terapeutici.

Strategie di trattamento attuali: un approccio multitarget

La SEU comprende l’insufficienza renale acuta e la sua conseguente perturbazione dell’equilibrio di fluidi ed elettroliti, l’emolisi, l’alterazione della cascata di coagulazione con trombocitopenia, con il rischio di ictus. Questa sindrome, insieme agli ulteriori effetti della tossina e alla formazione del complesso del complemento, deve essere gestita e affrontata con urgenza utilizzando un approccio multitarget. Questo comporta l’istituzione di misure di supporto generali, agenti antipiastrinici e trombolitici e inibitori della trombina, l’uso selettivo di antimicrobici, probiotici, neutralizzatori di tossine (leganti sintetici e naturali, anticorpi, e così via); e anticorpi contro elementi chiave della via patogenetica per interrompere i processi patologici (per esempio, inibizione della formazione terminale del complesso del complemento). Prendere di mira i PMN portatori di Stx potrebbe essere una strategia produttiva per la ricerca futura, così come una possibile terapia genica. La gestione della D+HUS è complessa in virtù della natura della condizione e della varietà delle vie interessate. La tabella 1 riassume l’approccio alla gestione ed elenca i trattamenti testati e sperimentali.

Misure generali di supporto

I livelli di fluidi e l’equilibrio elettrolitico sono estremamente importanti per prevenire e gestire lo sviluppo della SEU (vedi Tabella 1).

Terapia sostitutiva renale acuta (ARRT); per esempio, dialisi peritoneale (PD) o emodialisi) ha dimostrato di migliorare gli esiti. I bambini con D+HUS e danno renale acuto dato PD precoce possono avere risultati migliori senza rischio di sanguinamento in pazienti con bassa conta piastrinica. Inoltre, la procedura sembra sicura soprattutto nei casi con conta piastrinica molto bassa, senza episodi di sanguinamento registrati. In alternativa, l’emodialisi è spesso necessaria. La terapia antipertensiva per l’ipertensione, quando appropriata, è anche necessaria. Sembra esserci un ruolo benefico per l’infusione di plasma e lo scambio di plasma, tuttavia, il beneficio dell’aferesi rimane incerto.

Gestione dei problemi ematologici e della coagulopatia

Il monitoraggio di emoglobina, ematocrito e conta delle piastrine è essenziale. Il monitoraggio dell’emolisi con lattato deidrogenasi (LDH) e aptoglobina è anche utile. L’anemia risultante dall’emolisi può richiedere una correzione con trasfusioni di sangue intero o di globuli rossi confezionati. La trasfusione di piastrine è raramente richiesta e solitamente evitata.

Prevenire gli ulteriori effetti della tossina

Antimicrobici: usare o evitare?

A causa del potenziale rilascio indesiderato di verotossina (VT)/Stx da cellule batteriche morenti e morte, gli antibiotici sono solitamente evitati. Inoltre, il rischio di rilascio di endotossina potrebbe aggiungersi al carico già potenzialmente letale del paziente. Le concentrazioni subinibitorie in vitro degli antibiotici possono aumentare la produzione e il rilascio di VT/Stx attraverso l’induzione dei batteriofagi. Uno studio sui topi e sui maialini ha suggerito che gli studi sull’uomo della fosfomicina erano giustificati. Tuttavia, i dati prospettici raggruppati non hanno mostrato alcun beneficio degli antibiotici. È stato riportato solo uno studio sulla fosfomicina. Tuttavia, i dati sulla fosfomicina sono stati messi in discussione (vedi tabella 1). Mentre molti medici in Giappone usano ancora gli antibiotici, compresa la fosfomicina, nei pazienti con infezioni enteriche STEC certe o possibili, il consenso prevalente altrove indica che gli antibiotici dovrebbero essere evitati. Prove più recenti sostengono questo soprattutto in relazione ai β-lattamici e altri antibiotici battericidi.

Nutralizzatori di tossine (leganti sintetici e naturali, anticorpi e così via)

Sono state proposte strategie che utilizzano mimici di ligandi del recettore per Stx, la globotriaosilceramide (Gb3), legandosi a Stx nel tratto gastrointestinale con l’intenzione di prevenire la diffusione della tossina a siti extraintestinali. Tuttavia, nella pratica clinica il danno è già stato fatto prima che questi ligandi possano essere di beneficio. Solo uno studio clinico è stato condotto (purtroppo senza successo) con un agente, Synsorb PK, che ha dimostrato questo fatto. Altri agenti sono elencati nella tabella 1.

I neutralizzatori intraluminali potrebbero essere efficaci nel ridurre l’assorbimento sistemico della tossina, ma poiché la tossina non si trova nel siero, gli studi progettati per esaminare l’effetto dei neutralizzatori sugli effetti tossici della tossina associata ai leucociti polimorfonucleati sarebbero un primo passo.

Anticorpi

Gli anticorpi neutralizzanti specifici per la tossina Shiga sono potenzialmente utili come agenti terapeutici. Le tossine sono tossine AB con elementi attivi e leganti e sono obiettivi ovvi per la neutralizzazione degli anticorpi. Gli anticorpi monoclonali che mirano agli epitopi della subunità A di Stx1 hanno dimostrato di essere altamente protettivi, quando somministrati ad animali trattati letalmente. L’immunoglobulina somministrata per via orale è stata usata terapeuticamente per una serie di infezioni gastrointestinali (per esempio, rotavirus; Gastrogard-R). I pazienti con diarrea causata da E. coli diarroici, in particolare STEC ed E. coli che esprimono intimina e HEC-emolisina sono stati trattati con la somministrazione di colostro bovino in pool, ricco di anticorpi alla tossina di Shiga e all’E. coli-emolisina enteroemorragica, in uno studio in doppio cieco controllato con placebo. Sono state valutate la risoluzione dei sintomi e l’escrezione fecale dei ceppi infettivi. Non è stato possibile dimostrare alcun effetto della terapia con colostro sul trasporto degli agenti patogeni o sulle complicazioni dell’infezione, tuttavia la frequenza delle feci è stata ridotta. L’anticorpo al lipopolisaccaride di E. coli (LPS) ha anche il potenziale di uso terapeutico attraverso il suo effetto di blocco sull’aderenza di STEC alla linea cellulare epiteliale intestinale umana (Henle 407). Allo stesso modo, sarebbero necessari studi sull’uomo per dimostrare l’efficacia clinica.

Altri leganti/neutralizzatori di tossine

La maggior parte di questi agenti si lega alla tossina direttamente e inibisce il legame al suo recettore presente sulle cellule bersaglio. Questi nuovi neutralizzatori di Stx offrono una nuova modalità terapeutica contro le infezioni da STEC/EHEC e sono descritti in dettaglio nella tabella 1.

Collettori di tossine applicati sistematicamente (per via endovenosa)

Un peptide permeabile alle cellule (TVP) che si lega a Stx2 ha dimostrato di ridurre la gravità della malattia e di salvare i babbuini giovani da una dose letale di Stx2 (50 ng/kg).

Bloccanti del traffico endosoma-Golgi di Stx

Di recente è stato dimostrato che il metallo manganese (Mn2+) blocca il traffico endosoma-Golgi di STx. Questo offre un possibile approccio terapeutico a basso costo. (Tabella 1).

Bloccatori dell’interazione tra batteri e cellule ospiti: probiotici

Gli agenti patogeni intestinali mostrano molecole di superficie che permettono all’organismo di legarsi ai recettori delle cellule ospiti. Allo stesso modo, le tossine batteriche richiedono recettori della cellula ospite per il legame e l’ingresso nella cellula. Per bloccare l’interazione tra microbo e cellula ospite sono stati sviluppati dei probiotici ‘designer’. I batteri ricombinanti innocui esprimono molecole che imitano i recettori della cellula ospite (per esempio, Gb3) sulla loro superficie, ingannando così il patogeno ad attaccarsi al probiotico piuttosto che al recettore della cellula ospite. I batteri probiotici devono sopravvivere al viaggio nel tubo incontrando enzimi digestivi e altre condizioni avverse. Si attendono dati sperimentali.

Un approccio diverso ha utilizzato il surnatante di colture di Bifidobacterium longum HY8001, progettato per inibire l’effetto di VT/Stx attraverso l’interferenza della subunità B dei VT nel legame con Gb3 .

Inibizione della formazione del complesso terminale del complemento

Sulla base dell’evidenza che la tossina di Shiga attiva il complemento e lega il fattore H e dell’evidenza di un ruolo attivo del complemento attraverso la via alternativa nella sindrome emolitica diarrea-associata, sono stati pubblicati alcuni rapporti aneddotici sul trattamento di successo di gravi HUS associate a Stx con l’anticorpo monoclonale eculizumab. Neurologicamente, i tre pazienti sono migliorati notevolmente entro 24 ore dopo la prima infusione di eculizumab. Il miglioramento clinico è stato associato a una rapida normalizzazione dei marcatori di attività della malattia. Questi risultati iniziali sono estremamente promettenti e si attendono ottimisticamente i risultati di studi randomizzati controllati con placebo su larga scala.

Vaccini

Diverse strategie vaccinali sono state utilizzate con successo variabile in diversi modelli animali. Le strategie hanno coinvolto l’uso di proteine di virulenza ricombinanti come Stx, intimin e E. coli secreted protein A (EspA) o peptidi o proteine di fusione delle subunità A e B di Stx2 e Stx1 come Stx2Am-Stx1B o cellule fantasma avirulente di EHEC O157:H7 . L’applicazione di batteri vivi attenuati come Salmonella come portatore di proteine vaccinali contro patogeni delle mucose tra cui EHEC hanno evidenti vantaggi. Altri approcci sono elencati nella tabella 1.

Gli anticorpi prodotti negli esseri umani con HUS e nei conigli immunizzati con proteine secrete di tipo III (T3SP) da quattro sierotipi STEC, e nei bovini infettati sperimentalmente hanno rivelato proteine comuni a diversi sierotipi HUS (tabella 1). Questi erano altamente immunogenici in soggetti vaccinati e naturalmente infettati e rappresentano futuri candidati per un vaccino STEC (Tabella 1).

Come i vaccini a base di proteine, i vaccini a DNA sono uno sviluppo recente nella prevenzione dell’EHEC, fornendo risultati incoraggianti in un modello murino (Tabella 1).

La modalità di somministrazione (intramuscolare, intranasale, orale, intragastrica, e così via) per un certo numero di questi vaccini non solo influenza l’immunogenicità ma anche l’effetto protettivo sotto sfida. La vaccinazione con un vaccino orale a base di piante ha protetto i topi dall’intossicazione sistemica letale con Stx2 . Questo è considerato incoraggiante. Chiaramente c’è ancora un po’ di tempo prima che vengano riportati gli studi sull’uomo, ma le numerose e frequenti epidemie di EHEC ci ricordano costantemente l’urgente necessità di proteggere la popolazione da queste zoonosi emergenti e spesso devastanti.

Direzioni future e conclusioni

Sono ancora presenti barriere significative per un trattamento di successo della SEU, data la complessità della patogenesi della SEU, che comporta la perturbazione di percorsi omeostatici chiave che coinvolgono sistemi biochimici e fisiologici complessi. È improbabile che il targeting di un singolo percorso con una modalità di trattamento sarà sufficientemente successo; un approccio multitarget sembrerebbe necessario. Tuttavia, dato l’apparente successo di eculizumab, anche se con un numero esiguo di casi, potrebbe offrire una strategia promettente per il trattamento. Il trattamento ha lo scopo di prevenire le complicazioni più gravi dell’infezione da STEC (cioè l’insufficienza renale e le complicazioni nervose centrali, per esempio l’ictus e lo shock), che rimangono fin troppo comuni. È chiaro che una migliore comprensione della patogenesi della SEU porterà a ulteriori e forse migliori obiettivi per il trattamento. La scoperta che Mn2+ può bloccare il traffico da endosoma a Golgi porterà senza dubbio a studi randomizzati e controllati negli esseri umani. Questi saranno attesi con grande interesse. In termini di prevenzione, dovremmo mettere in discussione la globalizzazione della distribuzione del cibo con i suoi pericoli intrinseci e il suo spreco di risorse energetiche che si traduce in una gigantesca impronta di carbonio.