Generazione di topi knockout

Le tecnologie usate per generare topi knockout includono la ricombinazione omologa (o gene targeting) e la cattura dei geni. Entrambi gli approcci prevedono l’uso di cellule staminali embrionali di topo (ES) che vengono isolate da embrioni di topo a circa quattro giorni dalla fecondazione. Nel primo approccio, la ricombinazione omologa, il DNA artificiale con sequenze di accompagnamento che sono omologhe (identiche) a quelle che si verificano a monte e a valle della sequenza di DNA del gene bersaglio viene introdotto nel nucleo di una cellula ES di topo. La cellula ES riconosce le sequenze di accompagnamento omologhe e scambia il DNA del gene bersaglio esistente con segmenti del DNA estraneo. Il DNA estraneo, tuttavia, è inattivo. Quindi, la sua incorporazione nel genoma della cellula ES inattiva, o mette fuori uso, il gene bersaglio. Il DNA estraneo è tipicamente ingegnerizzato per portare un gene reporter, che segna o etichetta la posizione del gene esistente, permettendo ai ricercatori di seguire la sua presenza nel genoma delle cellule del topo mentre le cellule si replicano. La ricombinazione omologa è il metodo di scelta quando è richiesto che un allele specifico (gene) sia sostituito da una sequenza di DNA ingegnerizzato senza influenzare altri geni nel genoma.

Il gene trapping fa anche uso di DNA artificiale che porta un gene reporter. Tuttavia, piuttosto che mirare a un gene specifico, il DNA estraneo è incorporato casualmente in qualsiasi gene nel genoma delle cellule ES del topo. La sequenza estranea impedisce al gene interrotto di codificare i suoi prodotti proteici, rendendo così il gene inattivo. L’attivazione del gene reporter dopo l’incorporazione nel genoma delle cellule ES permette ai ricercatori di seguire l’attività del gene e di dedurre la funzione del gene danneggiato.

Le sequenze di DNA artificiale sono tipicamente introdotte nelle cellule ES del topo usando un retrovirus o un altro vettore virale, e le cellule ES modificate sono poi coltivate in colture cellulari. Dopo alcuni giorni, le cellule vengono iniettate nei primi embrioni di topo, che successivamente vengono impiantati nell’utero di una femmina surrogata, dove alla fine si sviluppano e vengono portati a termine. I cuccioli di topo nati in questo modo contengono sia tessuto modificato che non modificato e quindi non sono topi knockout completi. Per generare una coppia di veri topi knockout (knockout omologhi), i topi devono essere allevati per diverse generazioni. Inizialmente, gli animali sono incrociati con altri topi per produrre individui eterozigoti (topi con una copia del gene bersaglio); gli animali eterozigoti sono poi interbred per produrre omozigoti.

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