Terapia genica mediata da virus adeno-associati (AAV) per disturbi di origine ereditaria e non ereditaria
Terapia genica per disturbi non ereditari
Sono stati fatti molti progressi nell’identificazione dei meccanismi coinvolti nei danni cronici agli organi che hanno aperto la strada a studi di terapia genica. Mentre una pletora di studi preclinici e clinici negli ultimi decenni si è concentrata sullo sviluppo della terapia genica per i disturbi ereditari, nonostante i numerosi studi preclinici in modelli animali, ci sono stati solo pochi studi clinici che sono stati intrapresi per indagare l’efficacia terapeutica della terapia genica per le malattie non ereditarie. Uno studio recente mostra che l’espressione della telomerasi mediante vettori AAV9 esercita effetti terapeutici in un modello murino di fibrosi polmonare. Questa terapia aveva come obiettivo la fibrosi polmonare idiopatica. È noto che i telomeri agiscono come strutture protettive alle estremità dei cromosomi e la presenza di telomeri corti ha dimostrato di essere una delle cause dello sviluppo della malattia. In questa condizione, i telomeri diventano troppo corti, causando la cessazione della divisione cellulare che a sua volta porta all’apoptosi delle cellule. La telomerasi è un enzima che può ristrutturare la lunghezza dei telomeri, e Povedano e colleghi hanno sviluppato un trattamento utilizzando AAV sierotipo 9 per fornire telomerasi per correggere i telomeri corti. Poiché AAV9 si rivolge preferenzialmente alle cellule alveolari rigenerative di tipo II (ATII), i topi trattati con AAV9-Tert mostrano una migliore funzione polmonare con una riduzione dell’infiammazione e della fibrosi a 1-3 settimane dal trattamento con il vettore. È interessante notare che la fibrosi polmonare è migliorata o scomparsa a 8 settimane di terapia genica. Il trattamento AAV9-Tert ha portato a telomeri più lunghi e a una maggiore proliferazione delle cellule ATII, così come a un minore danno al DNA, apoptosi e senescenza.
La terapia genica cardiaca derivata da vettori AAV sta emergendo come una piattaforma completamente nuova per trattare i disturbi cardiaci. La terapia genica AAV per l’insufficienza cardiaca è stata convalidata in studi preclinici utilizzando modelli animali, e la maggior parte di questi approcci sono stati intrapresi per migliorare la gestione del calcio da parte dei cardiomiociti. La proteina terapeutica utilizzata nella maggior parte di questi studi era la calcio ATPasi sarcoplasmatica (SERCA2a). Sulla base dei risultati preclinici positivi, il primo studio clinico (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) è stato condotto per fornire SERCA2a utilizzando il vettore AAV sierotipo 1 per trattare pazienti con insufficienza cardiaca avanzata. Il risultato di questo studio di fase 1 ha avuto successo senza eventi avversi ed è stato portato avanti allo studio di fase 2a, fornendo risultati promettenti con un tasso significativamente basso di eventi avversi. Tuttavia, i risultati dello studio clinico di fase 2b (studio CUPID2b, NCT01643330) utilizzando lo stesso vettore sono stati deludenti con nessun cambiamento significativo tra il gruppo di trattamento e il gruppo placebo. Questo ha portato alla cessazione del reclutamento di pazienti per due ulteriori studi utilizzando AAV1.SERCA2a. È interessante notare che ci sono due nuovi studi imminenti volti a fornire S100A1 con un vettore AAV9 e una forma costitutivamente attiva degli inibitori della fosfatasi proteica 1, I1c, con un capside chimerico con sierotipi AAV2 e AAV8. Inoltre, AAV1, AAV6 e AAV9 sono emersi come i sierotipi AAV più promettenti per il trasferimento di geni cardiaci, il che fornisce speranze per approcci di terapia genica di successo per trattare l’insufficienza cardiaca in futuro.
Sono stati riportati anche approcci di terapia genica mediati da AAV per trattare il dolore neuropatico nei roditori. Fischer e colleghi hanno dimostrato che la somministrazione di rAAV che esprime il gene Ca2+ channel-binding domain 3 (CBD3) ha ridotto significativamente il comportamento doloroso come l’iperalgesia dopo il tocco con uno spillo o la sensibilità alla stimolazione con acetone in modelli animali di dolore infiammatorio e neuropatico. Un altro studio utilizzando il vettore AAV9 che codifica l’RNA a forcina corta (shRNA) contro il recettore vanilloide 1 (TRPV1), che è un importante gene bersaglio per il dolore acuto, ha dimostrato che la terapia ha attenuato l’allodinia termica indotta dalle lesioni nervose (aumento della risposta dei neuroni) 10-28 giorni dopo il trattamento in un modello murino di lesione nervosa risparmiata (SNI) . Questi risultati forniscono prove positive per incoraggiare i ricercatori di terapia genica a sviluppare trattamenti basati su vettori AAV per i pazienti con dolore neuropatico cronico/diabetico.
Considerevoli progressi sono stati fatti nell’approccio della terapia genica per trattare la fibrosi epatica cronica. Anche se gli inibitori dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE) o i bloccanti del recettore dell’angiotensina (ARB) sono ampiamente utilizzati come trattamenti in pazienti con ipertensione, sono stati sperimentati in pazienti con malattia epatica cronica; tuttavia, i risultati non erano convincenti soprattutto perché producono effetti collaterali sistemici avversi. A causa della mancanza di trattamenti medici, il trapianto di fegato è inevitabilmente diventato l’unica opzione per i pazienti con malattia epatica allo stadio finale, derivante da fibrosi epatica cronica e/o cirrosi. Inoltre, l’aumento dell’incidenza della malattia epatica cronica, la mancanza di organi di donatori, le complicazioni post-trapianto e l’alto costo del trapianto di fegato significano che c’è una grande necessità di scoprire e formulare nuove terapie specifiche, efficaci, sicure e poco costose per la fibrosi epatica/cirrosi.
Un possibile approccio per aggirare questo è quello di sviluppare strategie antifibrotiche mirate all’organo. Gli studi del nostro laboratorio hanno suggerito che un possibile bersaglio è l'”asse alternativo” del sistema renina-angiotensina (RAS), che comprende il suo enzima chiave, l’enzima di conversione dell’angiotensina 2 (ACE2), che scompone il potente octapeptide profibrotico, l’angiotensina II (Ang II) in un eptapeptide antifibrotico, l’angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)). Prove da studi sperimentali sugli animali hanno dimostrato che l’ACE2 umano ricombinante (rhACE2) è utile per la prevenzione dell’ipertensione nelle malattie cardiovascolari e per migliorare la funzione renale nella nefropatia diabetica. È interessante notare che rhACE2 è stato ben tollerato da un gruppo di volontari umani sani in uno studio clinico di fase 1, senza esercitare alcun effetto collaterale cardiovascolare indesiderato. C’è uno studio che ha riportato gli effetti terapeutici di ACE2 ricombinante nella fibrosi epatica sperimentale, in cui il danno epatico è stato indotto chirurgicamente da colestasi o da iniezione epatotossica di tetracloruro di carbonio. Hanno dimostrato che l’ACE2 ricombinante ha ridotto significativamente la fibrosi epatica in entrambi i modelli animali di malattia del fegato. Tuttavia, uno svantaggio importante di questo approccio sistemico è che il trattamento produce inevitabilmente effetti off-target, che in molti casi sono indesiderabili. Quindi, ci sono diversi svantaggi con la somministrazione sistemica di ACE2 ricombinante. Questo include iniezioni giornaliere di ACE2, una procedura che è invasiva in un ambiente clinico e approccio costoso con effetto indesiderato sulla regolazione della pressione sanguigna. Per aggirare questo problema, un approccio ideale sarebbe quello di aumentare i livelli di ACE2 tessuto-specifici nell’organo bersaglio. Così, organo-specifico aumento dell’attività ACE2 utilizzando un vettore AAV ricombinante fegato-specifico si prevede di produrre effetti terapeutici limitati all’organo mirato, riducendo al minimo gli effetti indesiderati fuori bersaglio.
Oltre all’uso di fegato-specifico sierotipo capside, specificità può essere ulteriormente migliorata da ingegneria il vettore con ACE2 gene sotto il controllo trascrizionale di un forte fegato-specifico promotore, apolipoproteina E / umano α1-antitripsina. Gli studi pubblicati dal nostro laboratorio hanno utilizzato un vettore AAV pseudotipato specifico per il fegato (rAAV2/8) per la valutazione preclinica e hanno scoperto che la sovraespressione epatica del gene ACE2 murino consegnato nei topi è durata fino a 6 mesi dopo una singola iniezione intraperitoneale. Abbiamo poi trattato i topi con una serie di modelli di malattia epatica, che comprendevano la fibrosi biliare indotta dalla legatura del dotto biliare (BDL), la lesione tossica indotta da iniezioni di tetracloruro di carbonio (CCl4), e la fibrosi epatica associata al fegato grasso indotta dall’alimentazione con dieta carente di metionina e colina (MCD) utilizzando una singola iniezione intraperitoneale di rAAV2/8-ACE2 . Il trattamento ha prodotto un importante aumento dell’espressione e dell’attività proteica di ACE2, che è stato confinato al fegato senza interessare altri organi principali. A differenza dei disturbi ereditari, per esempio, l’emofilia B dove un livello relativamente basso di espressione del transgene nel fegato può essere sufficiente per i successivi piccoli aumenti dei livelli di FIX nel sangue, la grandezza dell’espressione del transgene richiesta per l’intervento terapeutico nella malattia non ereditaria può essere sostanzialmente superiore. Questo, a sua volta, può rappresentare una sfida per i ricercatori di terapia genica. Tuttavia, è interessante notare che nel nostro approccio terapeutico mirato al fegato con rAAV2/8-ACE2, abbiamo trovato che l’aumento dell’espressione epatica di ACE2 ha ridotto il livello epatico di Ang II profibrotico di oltre il 50% rispetto a quelli trattati con un vettore di controllo che portava albumina di siero umano (rAAV2/8-HSA). La riduzione di Ang II, che è stata accompagnata da aumenti dei livelli epatici di peptide antifibrotico Ang-(1-7), ha portato ad una marcata riduzione dell’espressione delle citochine infiammatorie, portando ad una profonda riduzione della fibrosi epatica in tutti e tre i modelli (Figura 2) . Questi studi con modelli animali a breve termine sono stati ulteriormente convalidati per fornire la prova che in modelli animali a lungo termine di fibrosi biliare e di malattia del fegato grasso, che producono lesioni epatiche più comparabili a quelle viste nei pazienti con tali malattie, una singola iniezione intraperitoneale di rAAV2/8-ACE2 ha causato una profonda riduzione della fibrosi epatica (Figura 3). In netto contrasto con altri studi che utilizzano vettori AAV, abbiamo trovato che rAAV2/8-ACE2 ha ridotto i livelli sierici di alanina transaminasi (ALT) negli animali malati rispetto a quelli che hanno ricevuto il vettore di controllo (rAAV2/8-HSA), suggerendo che il vettore stesso è sicuro nel fegato. Inoltre, il vettore rAAV2/8-HSA (fino a 10 giorni) o rAAV2/8-ACE2 (fino a 24 settimane) iniettato in topi sani non ha prodotto alcun cambiamento nel livello di ALT nel plasma, confermando che è improbabile che il vettore stesso causi danni al fegato. La rappresentazione schematica del meccanismo molecolare associato alla terapia genica ACE2 utilizzando il vettore rAAV2/8 nella fibrosi epatica è mostrato nella Figura 4.
Figura 2.
Espressione genica epatica di ACE2 e fibrosi in tre modelli a breve termine di fibrosi epatica con terapia rAAV2/8-ACE2. L’espressione genica di ACE2 (A-C) era significativamente aumentata (p < 0,0001) nei topi malati trattati con ACE2 rispetto ai topi malati iniettati con il vettore di controllo (rAAV2/8-HSA) di BDL, CCl4 e MCD. Di conseguenza, la terapia genica rAAV2/8-ACE2 ha ridotto notevolmente la fibrosi epatica in ogni modello di topo (BDL, CCl4 e MCD).
Figura 3.
terapia rAAV2/8-ACE2 in topi Mdr2-KO con fibrosi epatica. La terapia genica rAAV2/8-ACE2 ha aumentato notevolmente l’espressione del gene ACE2 nei topi Mdr2-KO, mentre la fibrosi epatica è stata significativamente ridotta dalla terapia nei topi trattati con ACE2 rispetto ai topi Mdr2-KO iniettati dal vettore di controllo.
Figura 4.
RAAV2/8-ACE2 uptake dagli epatociti e una cascata di eventi innescati dalla proteina ACE2 nelle cellule stellate epatiche attivate (HSCs) durante la fibrosi. Le particelle rAAV-ACE2 utilizzano il recettore AAV (AAV-R) sulla membrana degli epatociti per entrare nel citoplasma, seguito dalla traslocazione nel nucleo dove avviene lo spacchettamento e il rilascio del genoma virale a singolo filamento. Il filamento complementare sarà poi sintetizzato per trascrivere ACE2. La proteina ACE2 legata alla membrana ha un ruolo esclusivo di scissione del potente peptide profibrotico angiotensina II (Ang II) in peptide antifibrotico angiotensina-1-7 (Ang-(1-7)). Mentre una riduzione dei livelli locali di Ang II porta a una significativa riduzione dell’attivazione del suo recettore, Ang II tipo 1 (AT1-R), l’Ang-(1-7) che lavora attraverso il suo recettore, Mas (Mas-R), inibisce la segnalazione a valle attivata da AT1-R come la produzione di ROS mediata da PKC e NADPH nelle CSE attivate. Questo a sua volta inibisce la fosforilazione delle MAPK come ERK1/2, JNK e p38, portando ad una riduzione delle citochine proinfiammatorie come IL-1, IL-6, IL-8, IFNγ, MCP-1 e TNFα e della citochina profibrotica TGFβ1. Una riduzione dell’attività del TGFβ1 porta ad una riduzione della fosforilazione dei suoi fattori di trascrizione, Smad2/3, con conseguente inibizione della secrezione di proteine della matrice come collageni e fibronectine. Così, rAAV-ACE2 aiuta a migliorare la fibrosi epatica e quindi il tono vascolare intraepatico, portando a un miglioramento dell’ipertensione portale. PKC, proteina chinasi C; NADPH ossidasi, nicotinamide adenina dinucleotide fosfato ossidasi; IL, interleuchina; IFNγ, interferone γ; MCP-1, proteina chemiotattica monocitaria 1; TNFα, fattore di necrosi tumorale α; TGFβ1, fattore di crescita trasformante-β1; ERK1/2, chinasi regolata extracellulare1/2; JNK, C-Jun N-terminal kinase.
Il rilascio di geni mirati al fegato utilizzando il vettore rAAV2/8 ha dimostrato di essere terapeuticamente promettente nel fegato adulto, ma i loro effetti non sono stati ampiamente studiati nel fegato immaturo. Anche se rAAV2/8 trasduce il fegato del topo neonatale con alta efficienza, il vettore non è persistente nel fegato e diminuisce rapidamente con la crescita del fegato. Pertanto, l’uso di successo della terapia mediata da rAAV2/8 per trattare le malattie del fegato nella prima infanzia può richiedere la risomministrazione. In linea con questo, un altro studio ha dimostrato che il trattamento di topi neonatali con deficit di ornitina transcarbamilasi (OTC) con terapia AAV2/8-OTC non è riuscito a proteggere i topi dall’iperammonemia in età adulta. Pertanto, la produzione di trasduzione stabile nel fegato in via di sviluppo rimane una delle maggiori sfide per la terapia genica rAAV2/8 specifica per il fegato, e la risomministrazione dei vettori può essere necessaria per mantenere l’efficacia terapeutica in età adulta dopo il trattamento neonatale precoce.
Anche se i vettori AAV impiegati per gli studi preclinici possono essere efficaci nel fegato umano, è importante selezionare un vettore AAV specifico per gli epatociti umani con maggiore efficienza di trasduzione. Recentemente, due gruppi hanno proposto di utilizzare topi umanizzati come il modello di topo immunosoppresso FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-) per identificare il miglior sierotipo rAAV per la terapia genica diretta al fegato. Gli studi nel modello di topo umanizzato ripopolato con oltre il 25% di epatociti umani hanno permesso ai ricercatori di identificare i vettori AAV specifici per il fegato umano, come LK-03 derivato dalla libreria AAV mescolata al DNA del capside. Questa libreria è stata generata utilizzando 10 geni del capside AAV. LK-03, che è composto da cinque diversi capidi AAV parentali, è stato in grado di trasdurre epatociti primari umani con maggiore efficienza in vitro e in un modello di xenotrapianto di carcinoma epatocellulare in vivo rispetto al sierotipo AAV 8. Wang e colleghi hanno anche riportato un più alto livello di trasduzione epatica in topi FRG usando il capside di AAVrh10, un AAV di clade E derivato dal macaco rhesus, e AAV3B e hanno dimostrato che i vettori AAV-LK-03 possono essere superiori sia ad AAV3B che ad AAV8 . Si prevede che i ricercatori utilizzeranno sempre più modelli animali umanizzati per malattie diverse da quelle del fegato, il che permetterà loro di identificare nuove varianti di vettori AAV ingegnerizzati, l’efficienza di trasduzione e le reazioni immunitarie specifiche per il tessuto umano in esame. Inoltre, è stato riportato che il vettore AAV3B-eGFP, che è stato in grado di causare l’espressione GFP robusto fegato-specifica nel fegato di primati non umani, è significativamente migliore di AAV8 senza epatotossicità apparente.