La protrombina svolge un ruolo fondamentale nella coagulazione del sangue (Fig. 1, 2). Le sue proprietà funzionali sono legate alla presenza di residui gamma-carbossiglutamilici (Gla), che risultano dalla carbossilazione post-traslazionale dipendente dalla vitamina K di dieci residui glutamilici specifici (Fig. 3,4). I miei studi bovini (ad esempio, esaminando il legame tra il legame degli ioni metallici e la funzione della proteina all’interno del complesso “”””””””prothrombinase””””””””) differenzieranno tra la legatura e le successive implicazioni conformazionali dei residui Gla nel normale processo fisiologico. In questo quadro, ho precedentemente isolato e caratterizzato sei diverse varianti di protrombina con deficit di Gla (0-,1-,2-,3-,5- e 7-Gla). Ognuno ha generato trombina quantitativamente ma ad un tasso marcatamente più lento (alto K/m) rispetto alla protrombina 10-Gla a causa della forte diminuzione di Ca/2+- e fosfolipide-binding rispetto alla normale protrombina 10-Gla. Sette e meno varianti Gla hanno rivelato solo il 3% della normale attività della protrombina, quando misurata dalla loro capacità di accelerare la coagulazione della protrombina e del plasma carente di fattore VII. Le protrombine 8- e 9-Gla appena isolate possiedono, rispettivamente, il 18 e il 75% dell’attività normale, fornendo una transizione tra le protrombine 7- e 10-Gla. L’isolamento delle varianti 8- e 9-Gla è diventato possibile grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali (McAb) contro la struttura stabilizzata al Ca2+ (Ca II Ab) della protrombina per la cromatografia di immunoaffinità. I miei studi immunochimici con Ca II Ab, policlonali e monoclonali, hanno dimostrato che essi (policlonali) non sono specifici per la protrombina normale in quanto reagiscono in modo incrociato con le varianti 7-, 8- e (particolarmente) 9-Gla. Inoltre, i miei dati preliminari con le protrombine 5- e 7-Gla suggeriscono che le posizioni Glu 15 e 17 non sono modificate, e le posizioni selettive (residui 7,8,20,30,33) possono essere preferenzialmente carbossilate. La ricerca proposta rivelerà se le protrombine carenti di Gla sono effettivamente selettivamente carenti, indicando l’ordine di “”””””””in vivo”””””””” carbossilazione dei residui Glu. La mia esperienza nel descrivere come la posizione e/o il numero di residui Gla influenzano le proprietà funzionali, fisico-chimiche (conformazionali) e immunochimiche della protrombina e del frammento 1 contenente Gla costituisce la base per l’isolamento di materiali umani sia per studi di base che clinici. Isolerò le protrombine normali e le più importanti con deficit di Gla. Queste ultime saranno poi divise in due (o più) gruppi in base alla loro attività fisiologica. L’obiettivo sarà quello di monitorare il plasma dei pazienti in terapia con warfarin per le protrombine normali, 9-Gla (se questa è l’unica funzionalmente attiva e totale (normale più Gla-deficiente) mediante immunodosaggi con anticorpi monoclonali specifici per valutare lo stato emostatico di questi pazienti.
Lo scopo è quello di determinare perché alcuni pazienti mostrano episodi trombotici mentre altri rimangono più inclini all’emorragia, anche se la loro bioattività plasmatica protrombina è mantenuta a livelli clinicamente accettabili. Inoltre, le protrombine carenti di Gla possono fornire un altro marcatore di disfunzione epatica.

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