γδ-selezione

Le cellule γδT emergono dai timociti DN, poiché il riarrangiamento delle catene TCRγ e δ avviene nelle fasi DN . Le cellule precursori γδ, che hanno TCRγ e δ riarrangiati prima della ricombinazione TCRβ, esprimono il complesso γδTCR/CD3 sulla membrana plasmatica, dove il γδTCR si autooligomerizza, come il pre-TCR, e avvia le vie di segnalazione intracellulari. Questo segnale γδTCR induce il processo denominato “γδ-selezione”, che conferma la generazione di catene TCRγδ funzionali, facendo riconoscere alla cellula che “sono una cellula γδT”.

Il segnale γδ-selezione innesca la differenziazione da cellule precursori CD5- CD24high γδ a cellule CD5+ CD24low γδT-committed. La transizione da CD5- a CD5+ cellule γδT è marcatamente compromessa nei topi con deficit di Syk, mentre i topi con deficit di Zap70 mostrano una normale differenziazione delle cellule CD5+ γδT. Zap70 / Syk doppiamente deficitario topi mostrano un arresto completo della differenziazione delle cellule γδT al CD5- stadio precursore. Così, la selezione γδ dipende principalmente dal segnale mediato da Syk, e Zap70 gioca solo un ruolo minore e ridondante in questo processo. Questo meccanismo è abbastanza analogo a quello della β-selezione. Un bersaglio critico di Syk nel segnale di γδ-selezione è il signalosome Lat, dato che i topi Lat-deficienti mostrano una completa inibizione della γδ-selezione e una totale mancanza di cellule γδT mature.

Le cellule precursori di γ da topi Syk/Zap70-deficienti o da topi Lat-deficienti sono indistinguibili dalle cellule del lineage αβT dall’espressione delle loro proteine di superficie cellulare, tranne la γδTCR, e mantengono ancora il potenziale per differenziarsi in cellule αβT. Cosa determina il destino di differenziazione nel lineage αβT o γδT dal precursore? Questa domanda è stata affrontata da studi che utilizzano topi transgenici γδTCR. Quando il segnale γδTCR è indebolito da una carenza di proteine di segnalazione o di ligandi endogeni per il γδTCR transgenico, le cellule precursori hanno dato origine a cellule DP di lignaggio αβT a spese delle cellule di lignaggio γδT. Questi risultati suggeriscono che un segnale più forte (probabilmente su interazione γδTCRligando) porta all’impegno di cellule γδT, mentre un segnale più debole (probabilmente da ligando-indipendente pre-TCR) porta alla differenziazione αβT. Tuttavia, gli esperimenti utilizzando un altro ceppo di topo transgenico che esprime il γδTCR con la stessa ligando-specificità hanno dimostrato che le cellule γδT erano in grado di maturare in assenza dei ligandi. Chien e collaboratori hanno impiegato un metodo di colorazione tetramerica per identificare la popolazione di cellule γδT ligando-specifiche al fine di esaminare il significato dei ligandi γδTCR endogeni nei topi non transgenici. I risultati hanno mostrato chiaramente che il numero delle cellule γδT ligando-specifiche era paragonabile tra i topi ligando-sufficienti e deficitari, suggerendo che la maggior parte delle cellule γδT non hanno incontrato i ligandi durante la differenziazione timica. Gli autori hanno anche fornito la prova che alcuni γδTCR possono segnalare in modo indipendente dai ligandi. Queste osservazioni contraddicono evidentemente il modello precedente che l’impegno del lignaggio γδT richiede l’interazione del ligando γδTCR. Dato che le cellule γδT policlonali reattive a certi ligandi esogeni si differenziano e maturano funzionalmente nel timo, è probabile che le osservazioni in certe linee di topi transgenici γδTCR non riflettano la maggioranza delle cellule γδT con γδTCR policlonali.

Per esaminare l’impatto del segnale di selezione γδ sulla differenziazione αβT/γδT, abbiamo utilizzato topi con deficit di Lat, in cui la differenziazione delle cellule γδT è arrestata allo stadio di precursore CD5. Le cellule precursori γδTCR+ sono state purificate da topi adulti con deficit di Lat, infettate con retrovirus che esprimono Lat, e coltivate su monostrati di cellule stromali (Fig. 2a). Questo esperimento permette la valutazione diretta del fenotipo cellulare prima e dopo la γδ-selezione in una condizione senza ligandi. Rispetto alle cellule di controllo non tradotte, le cellule γδT che esprimono Lat hanno mostrato una marcata induzione dell’espressione di superficie di CD5 (Fig. 2b), così come l’espressione dell’mRNA dei geni firma delle cellule γδT (Tcrd, Egr3, Runx3, e Bcl-2), e la completa abrogazione della trascrizione dei geni associati alle cellule precursori DN e cellule αβT (Rag1, Rag2, e Ptcra) (Fig. 2c). Questi risultati indicano che il segnale γδTCR sia guida la differenziazione verso il lignaggio γδT e reprime la differenziazione nel lignaggio αβT in un modo indipendente dai ligandi.

Nell’insieme, anche se i meccanismi sono ancora sfuggenti (e dibattuti) attraverso i quali il pre-TCR e il γδTCR dirigono i processi di differenziazione nei lineages αβT e γδT, rispettivamente, è probabile che la selezione γδ, almeno nella maggioranza delle cellule γδT generate naturalmente, non sia contingente al ligando γδTCR cognato nel timo.

La forza del segnale γδTCR determina la differenziazione γδT17/γδT1

Durante lo sviluppo di entrambi i lignaggi αβT e γδT, l’espressione di Syk e Zap70 è regolata in modo inverso: Syk è altamente espresso nelle fasi iniziali (DN1-3 e precursore γδ) e downregolato in seguito, mentre Zap70 è espresso nelle fasi successive (dopo la selezione β o la selezione γδ). Le cellule γδT che sono passate attraverso la selezione γδ esprimono alti livelli di Zap70 così come i complessi γδTCR/CD3 e possono rispondere ai ligandi endogeni se sono forniti nel timo. È attualmente riconosciuto che, a differenza delle cellule αβT, le cellule γδT non subiscono la selezione positiva guidata dai ligandi o la cancellazione clonale nel timo. Diversi studi hanno suggerito che l’interazione del ligando γδTCR nel timo controlla invece la funzione effettrice delle cellule γδT.

Utilizzando la colorazione tetramerica di una popolazione di cellule γδT che è reattiva alle molecole non classiche MHC di classe I T10 e T22, il gruppo di Chien ha trovato che le cellule γδT ingenue all’antigene che si sono sviluppate in assenza dei ligandi hanno prodotto preferenzialmente IL-17, mentre le cellule γδT con esperienza di antigene che si sono sviluppate in presenza dei ligandi hanno prodotto prevalentemente IFNγ . Questo studio ha suggerito per la prima volta l’idea che un segnale γδTCR forte indotto dai ligandi e un segnale γδTCR debole inducano rispettivamente le cellule γδT1 e γδT17. Uno studio recente con topi T10/T22-deficienti di nuova generazione ha riportato essenzialmente gli stessi risultati, sostenendo questo “modello di forza del segnale”. Questo modello è stato ulteriormente sostenuto da altri studi. La maturazione timica e la differenziazione effettrice delle cellule Vγ5Vδ1 γδT richiedono Skint1 (e probabilmente altre proteine della famiglia Skint), una proteina costimolatoria putativa per il TCR Vγ5Vδ1. In assenza di Skint1, le cellule Vγ5Vδ1 γδT sono mal indirizzate verso un fenotipo cellulare γδΤ17 a spese del fenotipo cellulare γδΤ1. Inoltre, lo sviluppo delle cellule γδT1 richiede anche la costimolazione tramite CD27, una proteina della superfamiglia dei recettori TNF espressa nelle cellule γδT1, ma non nelle cellule γδT17. Più recentemente, il gruppo di Pennington ha identificato le cellule γδT timiche bipotenti (CD24lo CD44lo CD45RBlo) che possono dare origine sia alle cellule γδT17 che alle cellule γδT1. Nella coltura di organi del timo fetale, lo sviluppo delle cellule γδT17 è stato inibito da forti segnali TCR indotti dalla stimolazione con anticorpi anti-TCRδ o anti-CD3ε, ma questi effetti sono stati abrogati dall’inibizione farmacologica della via MEK/ERK. Questi dati forniscono una prova diretta a sostegno dell’idea che la forza del segnale γδTCR è un determinante critico della funzione effettrice delle cellule γδT.

A livello trascrizionale, il forte segnale γδTCR induce l’espressione dei regolatori trascrizionali associati a γδT1, come Egr2, Egr3 e Id3, con conseguente destino delle cellule γδT1. Id3 inibisce l’adozione del destino cellulare γδT17 inibendo la regolazione trascrizionale mediata da HEB (codificato da Tcf12). HEB può legarsi direttamente a monte dei siti di inizio trascrizione di Sox4 e Sox13 per promuovere la loro espressione. Questi fattori trascrizionali associati a γδT17 sono necessari per l’espressione del fattore trascrizionale essenziale RORγt (codificato da Rorc) e la proteina di segnalazione Blk. Considerando questi fatti, il modello della forza del segnale TCR dimostra chiaramente i meccanismi attraverso i quali il segnale TCR controlla la funzione effettrice delle cellule γδT.

Tuttavia, una serie di studi ha dimostrato l’impatto dell’ablazione genetica delle molecole di segnalazione TCR sulla funzione effettrice delle cellule γδT, sfidando l’idea che la forza del segnale γδTCR determini da sola il destino differenziativo γδT17/γδT1. I topi mutanti Zap70 W163C mostrano una perdita completa dello sviluppo delle cellule γδT17 Vγ6+ ma hanno uno sviluppo normale delle cellule γδT1, mentre i segnali TCR sono smorzati in questi topi. Un altro studio di Silva-Santos e collaboratori ha dimostrato che i topi aploinsufficienti per CD3δ e CD3γ (CD3DH), che avevano una minore espressione della superficie cellulare dei complessi γδTCR/CD3 e una segnalazione γδTCR compromessa, ha mostrato una marcata riduzione dello sviluppo timico delle cellule Vγ6+ γδT17 e delle cellule γδT1, ma non delle cellule Vγ4+ γδT17, indicando che i sottoinsiemi γδT17 richiedono una forza di segnale γδTCR diversa per il loro sviluppo. Anche se lo sviluppo delle cellule αβT e la trasduzione del segnale αβTCR erano inalterati nei topi CD3DH, questo ceppo di topi è l’unico modello animale finora in cui è stata dimostrata l’inibizione specifica della segnalazione γδTCR. Non è ancora chiaro perché le cellule γδT sono specificamente colpite nei topi CD3DH, ma è probabile che la composizione distinta dei complessi TCR-CD3 delle cellule αβT e γδT spieghi il fenotipo unico dei topi CD3DH. In questo contesto, va notato che i topi con la mutazione CD3ε C80G, che non è in grado di indurre cambiamenti conformazionali nel TCR, mostrano anche un alterato sviluppo delle cellule γδT17 ma un normale sviluppo delle cellule γδT1.

Syk è richiesto per la differenziazione γδT17

Di recente, abbiamo riportato un nuovo meccanismo di regolazione attraverso il quale le chinasi prossimali γδTCR Syk e Zap70 controllano in modo diverso l’induzione γδT17 . I topi con deficit di Syk mostrano una perdita completa di cellule γδT17 (sia i sottoinsiemi Vγ4+ che Vγ6+) nel timo. In particolare, l’espressione forzata di Zap70 nelle cellule T-progenitrici con deficit di Syk non è riuscita a ripristinare la generazione di cellule γδT17, suggerendo un ruolo non ridondante di Syk nella differenziazione γδT17. Poiché le cellule γδT carenti di Syk, ma non di Zap70, mostrano una significativa riduzione della fosforilazione di Akt indotta dalla stimolazione di γδTCR, è indicato che Syk media l’attivazione indotta da γδTCR della via PI3K-Akt. I topi carenti di PI3K (p110γ-/- p110δ-/-) mostrano un’inibizione completa dello sviluppo delle cellule γδT17 ma non sono influenzati in termini di γδ-selezione (CD5 upregulation) o di sviluppo γδT1. L’inibizione di PI3K ha dimostrato di ridurre l’espressione dei fattori di trascrizione associati a γδT17 (Rorc, Sox13 e Sox4), suggerendo un ruolo cruciale per la via PI3K-Akt nell’indurre il programma di differenziazione γδT17. In accordo con questo, un rapporto precedente ha dimostrato che i topi kinase-inactive PI3Kδ o PI3Kγ-deficienti mostrano una marcata riduzione del numero di cellule periferiche γδT17 e un miglioramento dell’infiammazione γδT17-dipendente. La via PI3K-Akt è anche richiesta per la differenziazione delle cellule αβT (Th17) produttrici di IL-17, suggerendo che questa via di segnalazione è un meccanismo di regolazione comune condiviso dai lignaggi αβT e γδT per indurre sottoinsiemi proinfiammatori produttori di IL-17.

γδTCR indotta l’attivazione della via PI3K-Akt dipende da Syk ma non Lat, indicando che Syk guida la via PI3K-Akt per indurre la differenziazione γδT17 oltre alla via di segnalazione principale Lat-dipendente che induce la selezione γδ. Non è chiaro se Syk attiva la via PI3K/Akt nelle cellule γδT attraverso un’interazione diretta o in modo indiretto. Uno studio precedente ha riportato che i topi carenti di Rasgrp1 mostrano un fenotipo effettore delle cellule γδT simile a quello dei topi carenti di PI3K (cioè, una perdita di cellule γδT17 e un aumento di cellule γδT1). Poiché Rasgrp1 può funzionare come un attivatore a monte della via PI3K/Akt nella segnalazione αβTCR, è probabile che Rasgrp1 trasmetta i segnali da γδTCR a PI3K per indurre la differenziazione γδT17.

La perdita preferenziale di cellule γδT17 è stata riportata anche in topi carenti di Blk, una chinasi della famiglia Src espressa nelle cellule γδT e nelle cellule B, anche se la sua funzione nella trasduzione del segnale γδTCR è sconosciuta.

Zap70 controlla alcuni sottoinsiemi di cellule γδT

Abbiamo anche dimostrato il ruolo di Zap70 nella differenziazione timica delle cellule γδT. I topi con deficit di Zap70 mostrano una marcata riduzione delle cellule Vγ6+, la maggior parte delle quali sono γδT17, ma non sono influenzati in termini di sviluppo di altre cellule γδT, tra cui i sottoinsiemi Vγ1+ e Vγ4+. Infatti, il livello di espressione della proteina Zap70 era più alto nel sottogruppo Vγ6+ tra le cellule γδT. Poiché l’espressione CD5 era più bassa nelle cellule Vγ6+ con deficit di Zap70 rispetto alle cellule di controllo, Zap70 è probabilmente richiesto per la maturazione timica delle cellule Vγ6+. Nei nostri esperimenti, i topi Zap70-deficienti avevano una normale differenziazione timica delle cellule Vγ4+, compreso il sottogruppo γδT17, che contraddice la relazione precedente in cui una mutazione ipomorfica Zap70 ha causato una riduzione delle cellule Vγ4+ γδT17 timiche. Questa discrepanza può essere dovuta ai diversi topi utilizzati nei due studi (gruppo di Hayday utilizzato ipomorfo Zap70 mutante topi su un BALB / C sfondo, mentre abbiamo usato Zap70 completo deficit di topi su un fondo C57BL / 6). Inoltre, i topi Zap70-deficienti visualizzato una significativa riduzione delle cellule periferiche Vγ4 +, che comprendeva sia il γδT17 e γδT1 sottoinsiemi, ma aveva Vγ1 + cellule non compromessa. Così, in contrasto con il suo ruolo essenziale nello sviluppo delle cellule αβT, il requisito di Zap70 è limitato alla maturazione timica delle cellule Vγ6+ e al mantenimento periferico delle cellule Vγ4+.

I nostri risultati sui diversi ruoli di Zap70 e Syk potrebbero fornire un nuovo indizio per comprendere i meccanismi di segnalazione γδTCR e lo sviluppo delle cellule γδT. Zap70 è richiesto per la segnalazione αβTCR e la segnalazione γδTCR in alcuni sottoinsiemi di cellule γδT. Nelle cellule αβT, l’attivazione di Zap70 dipende da Lck, che è accoppiato con i corecettori CD4 o CD8 che si legano a pMHC sulla superficie delle cellule presentanti l’antigene. Così, si suggerisce che Lck-Zap70 è un asse di segnalazione che è specializzato nel riconoscimento dell’antigene ottenuto dal contatto cellula-cellula; anche se nel caso delle cellule γδT, rimane poco chiaro come Zap70 sia attivato nonostante la mancanza di espressione di CD4 e CD8. Al contrario, Syk è associato con una vasta gamma di immunorecettori, tra cui pre-TCR, γδTCR, BCR e FcR. Poiché Syk è in grado di fosforilare gli ITAM e i bersagli a valle indipendentemente dalle chinasi della famiglia Src come Lck, questi recettori possono essere attivati indipendentemente dal ligando o dal legame con una varietà di antigeni solubili e di superficie cellulare. Così, l’utilizzo di Syk o Zap70 nella segnalazione dell’immunorecettore può dettare come il recettore riconosce l’antigene. Infatti, l’espressione di Syk al posto di Zap70 ha reso le cellule αβT capaci di rispondere alla stimolazione dell’anticorpo anti-CD3 solubile, mentre le cellule αβT normali hanno risposto solo agli anticorpi anti-CD3 multimerizzati che imitano l’interazione con pMHC sulla superficie cellulare. Questi risultati ci hanno spinto a ipotizzare che il modo di riconoscimento dell’antigene utilizzato dai linfociti potrebbe essere determinato non solo dal loro recettore di per sé, ma anche dall’uso distinto delle chinasi della famiglia Syk. Sulla base di questo concetto, prevediamo che ci sono ligandi γδTCR endogeni di superficie cellulare richiesti per la maturazione timica delle cellule Vγ6+, così come il mantenimento periferico delle cellule Vγ4+, e che le cellule Vγ1+ non richiedono ligandi γδTCR di superficie cellulare per il loro sviluppo e/o mantenimento.

Processi indipendenti e dipendenti dal γδTCR per l’induzione del γδT17

Un recente rapporto ha elegantemente dimostrato che le cellule γδT17 nascono da un progenitore che è distinto dagli altri sottoinsiemi di cellule γδT. È stato riportato che i progenitori intratimici di origine fetale che esprimono alti livelli di Sox13 sono stati identificati in una popolazione precedentemente classificata come timociti DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi). Questi progenitori Sox13+ hanno dato preferenzialmente origine a cellule γδT17 nel timo fetale ricostituito, mentre altri progenitori all’interno della popolazione DN2 non lo hanno fatto. Soprattutto, i progenitori Sox13+ erano rilevabili e i loro programmi di discendenza γδT17 erano intatti nei topi con deficit di TCRδ o Rag, indicando che il destino di discendenza γδT17 è “precablato” da un meccanismo intrinseco alle cellule, indipendente dal γδTCR. Un rapporto precedente, tuttavia, ha dimostrato che le cellule γδT17 possono svilupparsi dallo stadio DN2 (CD44 + CD25 + c-kithi) quando co-coltivate su un monostrato di cellule stromali che esprimono il ligando Notch. Ci può essere quindi la necessità di ridefinire gli stadi di differenziazione e le relazioni progenitore-discendente nello sviluppo delle cellule γδT.

La figura 3 riassume i processi di differenziazione delle cellule γδT e delle cellule αβT, evidenziando le differenze nel requisito dei segnali αβ/γδTCR e delle chinasi della famiglia Syk. Le prime fasi del differenziamento, cioè la β-selezione per il lignaggio cellulare αβT e la γδ-selezione per il lignaggio cellulare γδT, sono guidate dalla segnalazione ligando-indipendente pre-TCR o γδTCR, che serve come un checkpoint per le cellule che esprimono una catena TCRβ funzionale o una catena γδTCR, rispettivamente. Questi segnali recettoriali indipendenti dalla liganda sono iniziati da Syk, che è espresso nei timociti DN, compresi i precursori γδT. Nella discendenza delle cellule γδT, il segnale γδTCR mediato da Syk è richiesto anche per l’innesco della differenziazione delle cellule γδT17 attraverso l’attivazione della via PI3K. Durante la β-selezione e la γδ-selezione, l’espressione di Syk e Zap70 è regolata inversamente: Syk è downregolato mentre Zap70 è upregolato su segnalazione pre-TCR o γδTCR. Pertanto, la fase successiva della differenziazione del lignaggio αβT dipende dalla segnalazione αβTCR mediata da Zap70, che permette ai timociti DP di riconoscere i pMHC sulla superficie dei TEC per essere selezionati positivamente o negativamente in base alla forza dell’interazione αβTCR-pMHC. Al contrario, la segnalazione γδTCR mediata da Zap70 in risposta a ligandi endogeni determina la funzione effettrice delle cellule γδT: un segnale forte induce la γδT1, mentre un segnale debole/assente induce la γδT17.