Risultati e discussione

Sono state studiate le strutture e le energie di vari sistemi modello mutati di KSI lungo tre passi di reazione: primo, astrazione del protone C4-β (ES → TS1 → EI1); secondo, leggera rotazione di Asp-40 protonato (EI1 → TS2 → EI2); e terzo, donazione del protone in posizione C6-β da parte di Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), come mostrato in Fig. 1. Il profilo energetico previsto di WT (Fig. 2A) è simile a quello corrispondente sperimentale di Pollack e collaboratori (25). Va notato che a TS2 il substrato è parzialmente neutralizzato in quanto gli atomi H dei residui catalitici si avvicinano all’ossianione (O3) nel substrato e l’elettrone in eccesso si trasferisce dal substrato ai residui catalitici adiacenti attraverso i percorsi di legame H. Così, il substrato, Tyr-16/57, e Asp-103 condividono un’unità di carica negativa, e le loro distribuzioni di carica dipendono dalle affinità protoniche e dalle affinità elettroniche dei residui catalitici dei mutanti. Questo stato TS2 con residui catalitici è in contrasto con quello senza residui catalitici in cui il substrato è caricato negativamente di quasi un’unità.

Le nostre strutture tridimensionali calcolate di EIs (complessato con equilenina invece di steroide) corrispondono quasi esattamente le strutture a raggi x di PI(g′) e TI(g′). Nella struttura prevista del complesso Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenina, le due distanze dei valori d(O3-Or) per Tyr-16 e Asp-103 (2.54 e 2.55 Å, rispettivamente) sono in buon accordo con i dati x-ray (2.6 ± 0.1 Å per entrambi nel caso di PI e 2.58 ± 0.08 Å e 2.62 ± 0.07 Å, rispettivamente, nel caso di TI) (32, 33, 36). Poiché le strutture calcolate sono state ottimizzate senza vincoli, la corrispondenza delle geometrie sperimentali e teoriche indica che nell’enzima i residui chiave hanno interazioni quasi massime con il substrato senza deformazione.

È stato ipotizzato che in soluzione il sito attivo di TI possa avere la struttura diadica (Asp-99… Tyr-14… equilenina) (29), che è diversa dalle strutture a raggi x di TI e PI (32, 33). Tuttavia, un recente esperimento NMR per PI/equilenina ha indicato che, in PI(D40N)/equilenina, appare una risonanza caratteristica forte a 16,8 ppm, e una debole a 13,1 ppm (36), simile al caso in TI/equilenina dei gruppi di Mildvan (29) e Pollack (25). Questo risultato è anche dimostrato dai nostri calcoli ab initio del complesso Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenina, dove la forte risonanza down-field a 16,5 ppm è assegnato a Tyr-16. L’esperimento mostra anche che, nel mutante D103L + D40N, una forte risonanza down-field (assegnato a Tyr-16) appare, mentre nel mutante Y16F + D40N la forte risonanza scompare. Così, questo esperimento esclude chiaramente la struttura diadica in cui la forte risonanza di campo verso il basso è stata assegnata a Asp-103, che è H-bonded a Tyr-16 (36).

Le costanti di tasso assoluto possono essere studiate utilizzando le barriere di attivazione calcolate. Ai livelli B3LYP/6-31+G* e MP2/6-31+G*, la barriera di attivazione del WT di KSI è leggermente sottostimata, rispetto alla barriera sperimentale (da 10 a ≈11 kcal/mol) riportata da Pollack e collaboratori (46). Tuttavia, quando si tiene conto dell’effetto del mezzo dielettrico del KSI (31), la barriera di attivazione del WT è di 8,2 kcal/mol, in stretto accordo con il valore sperimentale. Una leggera sottostima di 2-3 kcal/mol potrebbe essere spiegata con un calcolo più accurato e un sistema di modelli più completo che includa residui apolari intorno al sito attivo. In contrasto con la barriera di attivazione assoluta, le barriere di attivazione relativa tra diversi mutanti e quindi il meccanismo di reazione sono abbastanza coerenti indipendentemente dal livello di calcolo a causa dell’effetto di cancellazione tra diversi sistemi modello che hanno ambienti simili. Così, utilizzando le barriere di attivazione relative tra i diversi mutanti, abbiamo ottenuto la reattività relativa (il rapporto tra la costante di velocità cinetica di un mutante e quella del WT) o log(kcat/kcat(WT)) con l’ipotesi che il trasferimento da ES a TS1 sia il passo determinante lungo i percorsi di reazione (vedi la nota della tabella 1). I calcoli MP2 rafforzano i risultati ottenuti a livello B3LYP. I valori previsti di log(kcat/kcat(WT)) sono in buon accordo con i valori misurati per PI (32-35) e TI (25-28, 31) (Tabella 1). Dato che la struttura tridimensionale (terziaria e quaternaria) altamente omologa e l’ambiente del sito attivo di TI sono simili a quelli di PI, ci si aspetta che le reazioni catalitiche nelle due KSI procedano nello stesso modo.

Fig. 2 mostra i profili di energie e distanze H-bond per vari mutanti lungo il percorso di reazione. I profili energetici complessivi (ΔE) (Fig. 2A) sono quasi simmetrici rispetto a TS2. Le barriere del primo e del terzo passo sono simili. Il secondo passo, che ha una piccola barriera (≈1 kcal/mol), non può essere rate-determinante perché comporta solo un leggero spostamento dell’atomo H attraverso una rotazione minima (solo di alcuni gradi perché Asp-40 è molto inclinato contro il piano del substrato) su un legame C-C (o legame C-H nelle Figg. 1 e 3). Così, la reazione può essere praticamente considerata come un meccanismo a due fasi. I residui catalizzano il primo passo donando (parzialmente) un protone al substrato (come acido), mentre il terzo passo è catalizzato dall’accettazione (parziale) di un protone dal substrato (come base). Fare riferimento alle distanze interossigeniche dei legami H e alla distanza fuori centro di un protone condiviso dal punto medio di O3 e Or dove il valore positivo/negativo indica che il protone è vicino ai residui/substrato.

Per i residui acidi con minore affinità protonica (pA nella fase gassosa o pKa nel mezzo dielettrico), la barriera di attivazione sarebbe più bassa per il primo passo e più alta per il terzo passo, mentre i residui basici con maggiore pA o pKa produrrebbero un effetto contrario. Di conseguenza, nel meccanismo enzimatico a due fasi il potere catalitico ottimale si ottiene quando i residui dell’enzima svolgono un doppio ruolo di donatore/accettore di protoni molto forte verso/dal substrato alternativamente (da nominare come catalizzatore anfiacido/base o buffer di protoni/elettroni) per la reazione complessiva. Nel mezzo dielettrico degli enzimi, l’effetto catalitico massimo si ottiene nel caso di pKas uguali di residui e substrato. Questa situazione è in contrasto con le reazioni single-step in cui una grande differenza di pKa aumenta la reattività (47, 48). La condizione di uguale pKas tra residui e substrato per il massimo effetto catalitico corrisponde al requisito dei residui nell’enzima di possedere pKas equivalenti con il substrato per formare i SSHB massimi (4-7, 15, 23, 24). Così, nel meccanismo di reazione a due fasi della KSI, gli SSHB come catalizzatori anfiacidi/basi insieme a navette di protoni parziali e ridistribuzioni di carica giocano un ruolo cruciale nella forte stabilizzazione degli EI da ≈15 kcal/mol nell’energia di stabilizzazione guidata dai residui e nell’accorciamento della distanza interossigeno dipendente dal percorso di reazione rispetto allo stato ES.

L’energia di stabilizzazione guidata dal residuo ΔΔEa è in una certa misura correlata al ΔdES a meno che il trasferimento di protoni avvenga dal residuo al substrato (cioè, a meno che il ΔrH sia in una regione negativa in Fig. 2C). Pertanto, la stabilizzazione a EIs e TS può essere correlata all’accorciamento della distanza del legame H, e quindi della forza del legame H, rispetto allo stato ES. Cioè, i normali (o ordinari) legami H (tra partner neutri) a ES tendono a diventare SSHB (che coinvolgono specie ioniche) a EIs e TS2. Quindi, questi legami brevi dovrebbero essere responsabili di una parte dell’abbassamento energetico guidato dai residui. Come per il trasferimento di protoni, il potenziale a ES è un pozzo singolo per tutti i mutanti, mentre la forma potenziale (vicino a EIs o TSs) nella regione dove ΔrH è vicino a zero (cioè, intorno a TS1/EI1 per c e EI1/TS2 per e e f in Fig. 2C) porta alcune caratteristiche di un doppio pozzo. Per un piccolo valore assoluto di ΔrH (<≈0.5 Å) (Fig. 2C), la barriera per il trasferimento di protoni risulta essere molto piccola nel nostro calcolo, e quindi i trasferimenti di protoni nel potenziale a doppio pozzo da soli non possono spiegare il drastico abbassamento della barriera di attivazione. Infatti, il caso g, in cui le caratteristiche del potenziale di tipo double-well quasi scompaiono con poco trasferimento di protoni, mostra un maggiore abbassamento dell’energia rispetto al caso f, che comporta il trasferimento di protoni in un potenziale di tipo double-well. D’altra parte, si dovrebbe notare in Fig. 2 D ed E che, dopo i trasferimenti di protoni, il ΔdES non è più accorciato ma leggermente allungato, mentre il ΔΔEa si abbassa ancora. Quindi, l’accorciamento della lunghezza del legame H da solo (cioè, ΔdES) non può spiegare il drastico abbassamento della barriera ai TS e agli EI (cioè, ΔΔEa). Quindi, l’abbassamento della barriera alle ST e alle IE deve essere spiegato da ulteriori forze di interazione, che saranno discusse in termini di interazioni orbitali molecolari (MO) tra substrati e residui (che coinvolgono riarrangiamenti elettronici indotti dal trasferimento di carica o ridistribuzioni di carica).

Nel caso di due residui concorrenti come in f e g, la stabilizzazione cumulativa delle IE/TS risulta in un kcat più elevato. Tuttavia, questo effetto è in qualche modo subadditivo (cioè, più piccolo della somma delle energie di stabilizzazione di ogni residuo) come risultato del ridotto potere protonico di rimozione dell’ossianione per ogni residuo a causa della presenza dell’altro residuo. Questa subadditività indica che gli SSHB coinvolgerebbero trasferimenti di carica e polarizzazione (cioè, interazioni elettrostatiche indotte) e possibilmente un parziale legame covalente. Infatti, la stabilizzazione degli EI e dei TS in presenza di residui catalitici deriva principalmente dalla delocalizzazione dell’elettrone in eccesso presente nel sito attivo per trasferimento di carica e polarizzazione, come si vedrà in seguito. Le cariche effettive di popolazione degli orbitali di legame naturale (49) del substrato nei casi a, c-e, e f al TS1 sono -0,57, ≈-0,43, e -0,37, rispettivamente. Così, la carica negativa del substrato è più ridotta in presenza di due residui catalitici. Questa riduzione deriva dal trasferimento dell’elettrone in eccesso dal substrato ai residui catalitici con grande affinità elettronica, che svolgono il ruolo di buffer per l’elettrone in eccesso. Anche se Asp ha un potere di rimozione degli elettroni più forte di Tyr, Tyr ha un’affinità elettronica più bassa di Asp. Quindi, Tyr è efficace quanto, o leggermente più efficace di Asp, nell’abbassare la barriera di attivazione. La stabilizzazione dei TS e degli EI in presenza di residui catalitici è altamente correlata all’abbassamento dell’energia dello stato di eccesso di elettroni, poiché lo spazio per ospitare l’elettrone in eccesso è ampliato con i residui catalitici in aggiunta al substrato. Questo abbassamento di energia è direttamente correlato al principio di incertezza; meno localizzato è l’elettrone in eccesso, più è stabilizzato.

I turni chimici calcolati (δ) si trovano ad essere in qualche modo correlati al più piccolo valore di d(O3-Or) per lo stesso numero di legami H, mentre la presenza di un secondo legame H aumenta δ a causa del maggiore effetto di screening. Sulla base dei nostri risultati, un grande valore di δ può spesso essere un buon indicatore di SSHB, ma δ è solo parzialmente correlato a kcat. Questa correlazione diminuisce particolarmente per grandi δ (>16 ppm) o piccolo valore assoluto di ΔrH (<0.5 Å), poiché la dipendenza di kcat da δ è stata messa in discussione (50).

L’abbassamento delle barriere di attivazione in presenza di residui catalitici è ben compreso dall’analisi MO (Fig. 3). La sorprendente distinzione nei livelli di energia MO di TS2 tra a e g deriva dalla natura quantistica della densità di elettroni in eccesso accumulata sul substrato attraverso la deprotonazione da parte di Asp-40. La conseguente stabilizzazione ottenuta dissipando parte della densità elettronica ai residui catalitici è dovuta al principio di incertezza menzionato prima, che è simile a quello che si osserva nel caso di un eccesso di elettroni che interagiscono con cluster di acqua (51, 52), che è a favore di uno spazio di cavità ragionevolmente grande. Così, la presenza dei residui catalitici (che svolgono il ruolo di tampone di carica attraverso il trasferimento parziale di elettroni dal substrato ai residui catalitici) riduce drasticamente l’accumulo di carica sull’ossianione. Questa stabilizzazione degli EI e dei TS è essenzialmente assistita dagli SSHB. Questo effetto è altamente potenziato in presenza sia di Asp-103 che di Tyr-16/57. Le energie MO del caso g sono quindi molto più basse di quelle del caso a. L’effetto del mezzo dielettrico dell’enzima non è così drastico come l’effetto del residuo catalitico che coinvolge il trasferimento di elettroni. Così, gli shuttle di protoni parziali e le ridistribuzioni di carica promosse dagli SSHB sono più responsabili dell’abbassamento dei TS e degli EI rispetto all’effetto dielettrico dell’enzima. Di conseguenza, l’effetto catalitico risulta da una combinazione favorevole di guadagni dalle energie elettrostatiche non indotte e dalle energie di interazione MO (polarizzazione, trasferimento di carica ed energia di legame covalente). Mentre il primo risulta dagli spostamenti parziali di protoni dovuti alla presenza di legami H carichi (e quindi legati alla forza degli SSHB), il secondo risulta principalmente dalla delocalizzazione elettronica a causa dei residui catalitici, che svolgono il ruolo di buffer per un elettrone in eccesso. Il guadagno di energia dell’interazione MO è strettamente legato all’interazione supplementare enzima-substrato promossa da SSHB.

L’energia di stabilizzazione può quindi essere rappresentata come la somma dell’energia potenziata del legame H carico (che coinvolge specie ioniche) di EIs/TSs rispetto al legame H normale (tra partner neutri) dell’ES e il guadagno di energia dell’interazione MO a causa delle ridistribuzioni di carica che coinvolgono la dissipazione di elettroni ai residui catalitici. Poiché i due termini di energia non sono facilmente separabili, è difficile stimare ciascun termine. Tuttavia, valutiamo tali termini nel caso d utilizzando il seguente metodo. Dal confronto delle energie di EI1 relative a ES in assenza e presenza di Tyr-16 (Y16), l’energia di stabilizzazione di EI1 da Y16 è 8,7 kcal/mol. Per studiare il contributo dell’interazione elettrostatica non indotta (che non include l’effetto di induzione elettrostatica del substrato + Asp-40 (D40) sul residuo Y16) alla stabilizzazione, abbiamo effettuato i calcoli di ES e EI1 nel caso in cui Y16 è sostituito da un residuo fantasma composto solo dalle sue cariche orbitali di legame naturale (NBO) (Y16q), che sono state calcolate per una singola molecola Y16 in assenza del substrato + D40. Quindi, il guadagno di energia di interazione elettrostatica non indotta (o guadagno di energia elettrostatica guidata dalla preorganizzazione) è di 4,4 kcal/mol, che è responsabile della maggiore forza di legame del legame H carico (cioè, SSHB stesso). Quindi, la differenza di energie di stabilizzazione tra l’effetto quantico completo di Y16 e l’effetto elettrostatico non indotto di Y16q (4,3 kcal/mol) dovrebbe provenire dall’energia di interazione elettrostatica indotta, dall’energia covalente, ecc. L’interazione elettrostatica indotta include effetti di polarizzazione e di trasferimento di carica. Per ottenere il guadagno di energia elettrostatica indotta, abbiamo prima ottenuto le cariche atomiche di Y16 (Y16qind), che include l’effetto di induzione in presenza del substrato + D40. Poi, abbiamo effettuato i calcoli dell’ES e dell’EI1 nel caso in cui Y16 è sostituito da un residuo fantasma (Y16qind) composto solo dalle sue cariche atomiche puntuali. Poiché questa energia di stabilizzazione è di 8,2 kcal/mol, il guadagno di energia elettrostatica indotta dall’interazione tra substrato + D40 e Y16 è di 3,8 kcal/mol. Così, il guadagno di energia dal trasferimento di carica e dalla polarizzazione è grande e paragonabile al guadagno di energia elettrostatica non indotta. Il residuo Y16 svolge importanti ruoli catalitici di tampone di carica per ritirare e mantenere una grande parte della carica negativa in eccesso nel substrato così come della corrispondente ridistribuzione della carica elettronica durante la reazione. Questa energia elettrostatica indotta deriva dall’energia di interazione MO dall’interazione quantomeccanica di carica elettronica tra il residuo catalitico (Y16) e il substrato + D40 (cioè l’energia di interazione substrato-residuo guidata da SSHB). Infine, il contributo energetico rimanente di 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol potrebbe corrispondere principalmente all’energia covalente non elettrostatica. Questa energia è piuttosto piccola, che è ulteriormente corroborata dalla nostra analisi MO che la sovrapposizione orbitale non elettrostatica nella SSHB stessa non è significativa.

Negli enzimi che coinvolgono il meccanismo di reazione a due fasi, un substrato non è completamente carico negativamente, ma è parzialmente anionico con dissipazione di elettroni ai residui catalitici. Così, in questo caso l’incremento di energia di stabilizzazione (≈10 kcal/mol a EI1) guidato da SSHB rispetto al normale legame H risulta essere non piccolo. Se l’energia SSHB viene estesa per includere le interazioni substrato-residuo dovute alle ridistribuzioni di carica sia nel substrato che nel residuo, l’energia di stabilizzazione è la somma dell’energia SSHB guidata dalla preorganizzazione e dell’energia di interazione MO guidata da SSHB. Tuttavia, se consideriamo solo la forza della SSHB stessa, l’incremento dell’energia di legame è molto ridotto (a ≈5 kcal/mol).