I cromosomi sessuali dei mammiferi hanno ruoli specializzati nello sviluppo delle cellule germinali maschili (XY) e femminili (XX) (1). Le anomalie dei cromosomi sessuali sono la causa genetica più comune di infertilità umana (2). Nelle trisomie dei cromosomi sessuali (SCT) Klinefelter (XXY) e sindrome del doppio Y (XYY), la spermatogenesi è interrotta da un eccesso di geni X e Y, rispettivamente (2). Gli uomini XYY sono comunemente fertili a causa della perdita spontanea del cromosoma sessuale in più (mosaicismo). Negli uomini XXY, il mosaicismo è meno comune. Il recupero dello sperma testicolare ha permesso la riproduzione da alcuni giovani uomini Klinefelter, ma ha meno successo nei pazienti più anziani (3, 4). Gli individui XXY e XYY senza cellule germinali XY sono infertili.

Per studiare l’infertilità SCT, abbiamo generato topi adulti XXY e XYY portatori dei transgeni reporter fluorescenti Blimp1-mVenus (BV) e Stella-ECFP (SC) (5) per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule germinali primordiali (PGCLCs) (6). XXY maschi sono stati creati accoppiando una femmina wild-type a un maschio variante del cromosoma sessuale che produce XY contenenti sperma (fig. S1). Generazione di topi XYY richiede l’eredità di un cromosoma Y da entrambi i genitori. Abbiamo quindi usato un cromosoma Y di tipo selvatico ereditato paternamente e un cromosoma Yd1 ereditato maternamente che non esprime il testicolo determinante Sry (fig. S1) (7). Come mostrato in precedenza (8, 9), il fenotipo spermatogenesi in entrambi i modelli ricapitolato che negli uomini SCT, con arresto allo stadio prospermatogonial in topi XXY e al pachynema in topi XYY (fig. S2). La spermatogenesi era normale nei fratelli transgenici euploidi XY BVSC.

In seguito, abbiamo stabilito fibroblasti da SCT e topi XY e XX di controllo (fig. 1A). L’ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (DNA-FISH) per il gene X Slx e il gene Y Sly ha confermato che il passaggio 4 (P4) dei fibroblasti SCT e di controllo aveva mantenuto i loro complementi originali dei cromosomi sessuali (Fig. 1B e fig. S3A). I fibroblasti sono stati riprogrammati in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) (10) in un modo doxiciclina (Dox)-inducibile. DNA-FISH è stata eseguita in risultante P2 iPSCs (Fig. 1A).

Un’alta percentuale di linee iPSC derivate da SCT ha mostrato la perdita del cromosoma sessuale. Da topi XXY, abbiamo osservato iPSC XY, XX e XO (Fig. 1, C ed E). L’incidenza della perdita era simile per i cromosomi X e Y (P = 0,062, test Mann-Whitney). Dai topi XYY, abbiamo osservato iPSCs XY e XO (Fig. 1, D e E). La perdita del cromosoma Y nei maschi XYY si è verificata con una frequenza simile a quella osservata per il cromosoma X e Y combinato nei maschi XXY (P = 0.089, test Mann-Whitney). Abbiamo poi confrontato l’incidenza della perdita dei cromosomi sessuali tra le iPSC derivate da SCT e quelle euploidi XY e XX. La perdita dei cromosomi sessuali era più comune nelle iPSC derivate da SCT che in quelle euploidi (Fig. 1E), indipendentemente dal cutoff utilizzato per definire la perdita dei cromosomi sessuali (fig. S12D).

La perdita dei cromosomi sessuali potrebbe verificarsi durante la riprogrammazione delle cellule SCT o durante la propagazione iPSC in P2, forse conferendo un vantaggio proliferativo alle cellule euploidi risultanti. Infatti, l’instabilità dei cromosomi sessuali è stata osservata nelle cellule staminali pluripotenti (11, 12). Per verificare quest’ultima ipotesi, abbiamo analizzato la stabilità dei cromosomi sessuali tra P2 e P6 in iPSCs con complementi altamente parentali (>90%) (fig. S4A). Abbiamo osservato la perdita del cromosoma sessuale nelle linee iPSC XX e XXY (P < 0,01 e 0,05, rispettivamente; Wilcoxon signed-rank test) ma non nelle linee iPSC XY e XYY (P = 0,21 e 0,66, rispettivamente; Wilcoxon signed-rank test). Tuttavia, nessuna linea iPSC ha mostrato più di una diminuzione del 15% del complemento parentale (fig. S4B). Inoltre, la perdita di cromosomi sessuali tra P2 e P6 non era trisomia-biased (fig. S4B). SCT-derivato euploide XY iPSCs anche esibito alcun vantaggio proliferativo rispetto XXY o XYY iPSCs (fig. S5). Poiché i fibroblasti SCT erano anche cariotipicamente stabili (Fig. 1B e fig. S3A), la perdita cromosomica è probabilmente indotta durante la riprogrammazione iPSC ed è quindi distinta dalla instabilità dei cromosomi sessuali nelle cellule staminali pluripotenti (11, 12). Ci riferiamo al fenomeno come trisomia-biased chromosome loss (TCL).

Abbiamo poi determinato se euploide XY iPSCs derivato da fibroblasti SCT avrebbe formato sperma funzionale. Abbiamo selezionato altamente euploide (≥80% delle cellule XY) P6 iPSCs adattate al mezzo senza Dox (fig. S6). Per i nostri esperimenti XYY, solo linee iPSC XY che hanno mantenuto il wild-type Y piuttosto che il cromosoma Yd1 sono stati utilizzati per esperimenti PGCLC (fig. S7). La cariotipizzazione ha confermato che tutte le linee iPSC XY derivate da SCT e una linea iPSC XY di controllo erano euploidi (fig. S8). Queste linee iPSC sono stati differenziati (6) attraverso un epiblasto-come stato per creare aggregati PGCLC positivo per BV e SC (Fig. 2A). Le PGCLC BV-positive (tabella S1) sono state isolate mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) (Fig. 2B) e trapiantate in testicoli W/Wv (Kit mutante) carenti di cellule germinali (13).

La spermatogenesi nei riceventi è stata valutata 9-10 settimane dopo il trapianto. I teratomi, che si osservano dopo il trapianto di PGCLC derivate da iPSC (6), erano presenti nel 29% delle linee trapiantate derivate da XXY e nel 50% di quelle derivate da XYY (fig. S9). La ricostituzione della spermatogenesi, rivelata dalla presenza di colonie spermatogeniche (fig. 2C) e dall’istologia (fig. 2D), è stata osservata per tutte le linee iPSC derivate da XXY e XYY utilizzate (tabella 1). Così, le iPSC XY derivate da SCT possono differenziarsi in cellule germinali in vitro e completare la spermatogenesi dopo il trapianto.

Abbiamo chiesto se lo sperma creato tramite trapianto potesse sostenere la riproduzione. L’iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI) utilizzando sperma da due linee iPSC XXY- e due XYY derivate da XY (Fig. 2E e fig. S10A) ha generato zigoti che si sono sviluppati in embrioni a due cellule in vitro (efficienza 76.7 a 87,3%) (Fig. 2F, fig. S10B, e tabella S2) e prole grossolanamente normale quando trapiantato in destinatari (efficienza 46,9 a 59,4%) (Fig. 2G, fig. S10C, e tabella S2). La genotipizzazione della reazione a catena della polimerasi ha confermato che la prole derivava dai PGCLC trapiantati (fig. S10D). I cuccioli delle linee iPSC derivate da XXY e XYY hanno mostrato una crescita comparabile a quelli derivati da iPSC XY di controllo (fig. S10E). In particolare, i cuccioli derivati da XXY e XYY avevano complementi euploidi (XY o XX) (fig. S11). Tre maschi maturi e tre femmine da ogni linea iPSC XXY- e XYY-derivato sono stati accoppiati tra loro, e tutti erano fertili (Fig. 2H e fig. S10F). Così, lo sperma da SCT-derivato iPSCs XY dare origine a cromosomicamente normale, sano e fertile prole.

Abbiamo affrontato se TCL è specifico per trisomia dei cromosomi sessuali. Poiché non sono disponibili modelli murini con trisomia di un autosoma completo (14), abbiamo ripetuto i nostri esperimenti in topi maschi transcromosomici Tc1, un modello di sindrome di Down con un cromosoma umano accessorio 21 (hChr.21) (15). I topi Tc1 portano una cassetta di resistenza alla neomicina hChr.21-inserita, la cui selezione riduce il mosaicismo hChr.21 (15). Abbiamo quindi prima arricchito fibroblasti adulti Tc1 per la presenza di hChr.21 utilizzando l’analogo neomicina G418 (Fig. 3A). DNA-FISH ha mostrato che la stragrande maggioranza (≥ 96%) dei fibroblasti Tc1 ha mantenuto hChr.21 (Fig. 3B e fig. S3B). Questi fibroblasti Tc1 sono stati riprogrammati senza selezione G418, e le iPSC risultanti sono stati analizzati a P2. Dieci delle 16 linee iPSC che sono stati generati (62,5%) ha mostrato la perdita di hChr.21 in ≥ 10% delle cellule (Fig. 3, C e D, e fig. S12D). Al contrario, dopo la rimozione G418, hChr21 è stato mantenuto in fibroblasti Tc1 coltivato per lo stesso periodo come quello utilizzato per la riprogrammazione iPSC (18 giorni) e in P6 linee iPSC che avevano altamente genitoriale (>90% hChr.21 positivo) complementi a P2 (fig. S12, A e B). Concludiamo che la perdita di hChr.21 nelle cellule Tc1 è promosso dalla riprogrammazione piuttosto che la rimozione G418 e quindi che TCL colpisce anche un cromosoma accessorio.

Allora ci siamo chiesti se la TCL si verifica nelle cellule umane. Casi di perdita cromosomica sono stati osservati durante la coltura di cellule umane trisomiche (16, 17), ma la sua prevalenza e la relazione con la riprogrammazione non è stata analizzata sistematicamente. Abbiamo selezionato la sindrome di Klinefelter umana, la sindrome di Down, e le linee di fibroblasti euploidi XY e XX che esibiscono un mosaicismo minimo (fig. S13, A e D), riprogrammati, e determinato i complementi cromosomici delle linee iPSC risultanti. Abbiamo osservato iPSC XY e XX dai fibroblasti della sindrome di Klinefelter e iPSC euploidi dai fibroblasti della sindrome di Down (fig. S13, B, C, F, e G). La perdita cromosomica era più comune nelle cellule trisomiche che in quelle disomiche, dimostrando che la TCL si verifica anche durante la riprogrammazione umana. Tuttavia, la frequenza di linee iPSC altamente euploidi era inferiore a quella osservata nelle iPSC di topo derivate dalla trisomia (fig. S13, da F a H).

Abbiamo dimostrato che la TCL produce iPSC euploidi da topi e pazienti SCT e trisomici autosomici (fig. S12E). Nei topi, le iPSC “corrette” risultanti possono formare sperma funzionale, permettendo la produzione di prole cromosomicamente euploide da individui SCT infertili. La TCL completa le terapie iPSC esistenti per le anomalie cromosomiche (17-21). I meccanismi che causano la TCL sono sconosciuti. Gli stress cellulari associati alla riprogrammazione possono selezionare le cellule trisomiche, permettendo l’emergere di cellule euploidi. Abbiamo osservato meno frequenti TCL in cellule umane che in cellule di topo (figg. S12D e S13H). Anche se rara, la TCL potrebbe offrire trattamenti per i pazienti infertili con SCT per i quali gli approcci alternativi non hanno successo. Tuttavia, l’uso clinico di cellule germinali umane prodotte in vitro dovrebbe essere attentamente considerato dal punto di vista etico e legale (22-24). Inoltre, la completa spermatogenesi in vitro dovrà essere sviluppata per evitare il rischio di formazione di teratomi derivanti dal trapianto di cellule germinali.

TCL permette anche la produzione di iPSC femminili da maschi, offrendo un potenziale per la dissezione genetica dei dimorfismi sessuali (25). Creando linee iPSC isogeniche che differiscono solo rispetto ai loro cromosomi sessuali, le differenze di sesso identificate durante la modellazione di malattie iPSC potrebbero essere attribuite a effetti cromosomici X o Y.