METODI DI TEST PER LA FOTOTOSSICITÀ E I METODI ALTERNATIVI SULL’ANIMALE

È essenziale garantire la fotosicurezza delle sostanze chimiche quando ci sono possibilità di esposizione umana, come può essere chiaramente esemplificato da prodotti farmaceutici (20) o cosmetici (21). Per valutare il potenziale di fototossicità di una sostanza chimica, sono stati introdotti vari metodi di test che vanno dall’in silico(22), in chemico(23), in vitro al saggio in vivo. Sono stati sviluppati e utilizzati abitualmente saggi in chemico come la generazione di ROS (24), test in vitro che includono il test 3T3 NRU e il modello di epidermide 3D, e studi in vivo che impiegano cavie, topi o ratti pigmentati (25).

Fonte di luce per la fototossicità. La fonte di luce per la fototossicità è estremamente importante poiché le lunghezze d’onda assorbite dalla sostanza chimica di prova (spettro di assorbimento) e la dose di luce (raggiungibile in un tempo di esposizione ragionevole) dovrebbero essere sufficienti per indurre la fototossicità (26). I simulatori solari che simulano la luce solare naturale sono considerati la fonte di luce artificiale ideale (Fig. 5).

La distribuzione della potenza di irradiazione del simulatore solare filtrato dovrebbe essere vicina a quella della luce del giorno esterna. I simulatori solari sono dotati di archi di xeno o di archi di mercurio-metallo alogenuri (drogati). Dovrebbero anche essere opportunamente filtrati per attenuare le lunghezze d’onda UVB altamente citotossiche. Lo spettro registrato al di sotto di questi filtri non dovrebbe discostarsi dalla luce diurna esterna standardizzata (Specifica: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

Tuttavia, anche altre fonti di luce UVA come la lampada UVA possono essere utilizzate con un dosimetro UV adeguato per controllare l’intensità e la lunghezza d’onda. L’intensità della luce (irradianza) varia a seconda delle fonti, e dovrebbe essere controllata regolarmente prima di ogni test di fototossicità utilizzando un adeguato misuratore UV a banda larga. Il misuratore UV deve essere calibrato prima di ogni misurazione. Di conseguenza, il tempo di irradiazione dipende dall’intensità della fonte di luce (ad esempio, per una fonte di luce di 1,7 mW/cm2, sono necessari 50 minuti di esposizione per ottenere 5 J/cm2). Il tempo di irradiazione varia anche a seconda dei metodi di prova. Una dose di 5 J/cm2 (misurata nella gamma UVA) è stata determinata per essere non citotossica ma sufficientemente potente da eccitare le sostanze chimiche per suscitare reazioni fototossiche nel saggio di assorbimento del rosso neutro 3T3.

3T3 Test di assorbimento del rosso neutro. Il test NRU 3T3 è stato ufficialmente approvato dall’OECD e approvato come OECD TG432 il 13 aprile 2004 (3). Questo test valuta la fotocitotossicità determinando la riduzione relativa della vitalità cellulare dopo l’esposizione all’articolo in esame in presenza o in assenza di irradiazione UV/VIS. La decisione di condurre il test di fototossicità 3T3 NRU è stata presa per le sostanze chimiche che mostrano spettri di assorbimento nella regione UV/VIS quando sciolte nel solvente appropriato (17). È stato suggerito che se il coefficiente molare di estinzione/assorbimento è inferiore a 10 litri x mol-1 x cm-1 è improbabile che la sostanza chimica sia fotoreattiva (ad esempio, in cuvetta UV con percorso della luce lungo 1 cm, OD della soluzione 0,05 M deve essere inferiore a 0,5 per essere considerata non fotoreattiva in base all’equazione “assorbanza = coefficiente di estinzione x lunghezza del percorso x concentrazione”) (26). Il test 3T3 NRU presenta una capacità predittiva altamente sensibile ma poco specifica (una sensibilità del 93% e una specificità dell’84%). Il test NRU 3T3 ha molte limitazioni. Non può prevedere effetti avversi diversi dalla foto(cito)tossicità che possono derivare dall’azione combinata di una sostanza chimica e della luce come la fotogenotossicità, la fotoallergia (fotosensibilizzazione) o la fotocarcinogenicità. Il test NRU 3T3 viene impiegato solo per l’identificazione del pericolo, mentre la sua utilità per la valutazione della potenza fototossica non è garantita. In particolare, questo sistema di test manca di attività metabolica che è fondamentale nella manifestazione di sostanze chimiche esposte sistematicamente. Pertanto, per le sostanze chimiche esposte sistematicamente che richiedono l’attivazione metabolica come la monocrotalina, la riddelliina e l’eliotrina (alcaloidi pirrolizidinici) (28), si raccomandano studi in vivo su animali (5,29).

Il principio fondamentale del test 3T3 NRU è il confronto della vitalità cellulare in presenza o in assenza di irradiazione UV/Vis come determinato con il colorante vitale, il rosso neutro, che è un colorante cationico debole che penetra facilmente le membrane cellulari e si accumula intracellularmente nei lisosomi delle cellule vitali. La linea cellulare di base è la cellula Balb/c 3T3, che è un fibroblasto di topo sviluppato da embrioni di topo da G.T. Todaro nel 1968. La denominazione 3T3 sta per “trasferimento di 3 giorni, inoculo di 3 × 105 cellule” in un piatto di 20 cm2, e questa cellula è relativamente stabile, facilmente disponibile e facile da maneggiare (30). Il fibroblasto dermico è una delle cellule bersaglio della fototossicità, il che fornisce una solida motivazione per l’impiego delle cellule 3T3.

Per decidere se l’articolo in prova è fototossico o meno nel saggio 3T3 NRU, la concentrazione-risposta deve essere ottenuta in presenza e in assenza di irradiazione. Si calcola il fattore di foto-irritazione (PIF) o l’effetto fotografico medio (MPE) (31). Il PIF è il rapporto tra IC50 (concentrazione che diminuisce la vitalità cellulare del 50%) di non irradiati su irradiati come mostrato in Fig. 7.

Modello di previsione della fotocitotossicità tramite PIF (Photo-irritation factor).

Quando IC50 non può essere ottenuto, MPE è calcolato come la seguente equazione

PIF < 2 o un MPE < 0,1 predice: “nessuna fototossicità”. Un PIF > 2 e < 5 o un MPE > 0,1 e < 0,15 predice: “fototossicità probabile” e un PIF > 5 o un MPE > 0,15 predice: “fototossicità” (Fig. 8).

Calcolo dell’effetto fotografico: Il foto effetto (PEC) a una concentrazione arbitraria C è definito come il prodotto dell’effetto di risposta (REC) e l’effetto della dose (DEC), cioè PEC = REC × DEC. La definizione è illustrata come adottata da (31). Il calcolo del fotoeffetto alla concentrazione 0,4 segue le equazioni date nel testo dà: effetto risposta RE0,4 = (66% – 11%)/100% = 0,55, effetto dose DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43, e effetto foto PE0,4 = 0,24. Il fotoeffetto medio si ottiene facendo la media dei valori del fotoeffetto a varie concentrazioni (31).

Test di emolisi degli eritrociti. Le membrane cellulari sono vulnerabili ai ROS e ai radicali generati dalla fotochimica. I danni indotti dagli UVA sugli eritrociti e la conseguente emolisi (fotoemolisi) vengono capitalizzati per valutare il potenziale fototossico degli articoli in esame (32). I globuli rossi di pecora (SRBC) sono incubati con prodotti chimici e irradiati con UVA a 20 J/cm2. Dopo l’irradiazione, i globuli rossi sono stati incubati al buio per 2 ore a temperatura ambiente e poi per altre 1 ora a 37℃, dopo di che l’emolisi è stata misurata con il reagente di Drabkin e la misurazione dell’assorbanza UV a 540 nm. L’estensione della fototossicità è stata valutata dal rilascio di emoglobina dalla SRBC, cioè l’attività fotoemolitica come segue l’equazione (33).

• ADE: densità ottica della soluzione di droga esposta con eritrociti

• AD: densità ottica della soluzione di droga esposta senza eritrociti

• C: densità ottica della soluzione di controllo emolitica al 100%

Fototossici come ciprofloxacina, norfloxacina o enoxacina aumentano significativamente l’attività fotoemolitica oltre il 20% a 100 μg/mL. La sensibilità, la specificità e l’accuratezza di questo test erano 67%, 73% e 73%, rispettivamente per 24 sostanze chimiche (8 fragranze, 5 assorbitori UV, 4 farmaci, 4 antimicrobici e 3 coloranti) rispetto al test in vivo su cavia (34). La bassa sensibilità può essere problematica e le sue prestazioni sono molto inferiori a quelle del test 3T3 NRU, il che può spiegare la diminuzione dell’uso di questo test di recente.

Modello di epidermide umana 3D in vitro. Per superare le limitazioni dei metodi in vitro basati sulle cellule, si sta studiando un modello di epidermide ricostruita in 3D per l’applicazione ai test di fototossicità (35,36). Fondamentalmente il principio del test è simile al test NRU 3T3, cioè la valutazione della differenza di vitalità del tessuto tra la presenza e l’assenza di irradiazione UV/VIS. Si può utilizzare un modello di predizione simile utilizzando PIF e MPE (37). Nel modello di epidermide 3D, tuttavia, i materiali insolubili in acqua possono essere testati e un certo grado di capacità metabolica è conservato nei cheratinociti primari nello strato epidermico che può essere applicato ai tossici che richiedono l’attivazione metabolica (38). Inoltre, la misurazione della produzione di citochine come IL-1β (Interleuchina-1β) (39), il test della cometa (40) e l’esame istologico sono possibili che possono essere considerati nell’ulteriore valutazione della fotoallergenicità e della fotocarcinogenicità.

Metodi in vivo utilizzando cavie, topi o ratti pigmentati. Animali da laboratorio come topi e cavie vengono impiegati per simulare lo scenario reale della fototossicità umana. Gli animali sono esposti a sostanze chimiche per via topica o sistemica e irradiati con una dose appropriata di UVA (generalmente 10 J/cm2 per il test delle cavie, 20 J/cm2 per il test del topo (41)). Il punteggio dell’eritema e dell’edema da 0 a 4 viene sommato e il punteggio massimo durante 72 ore di osservazione viene calcolato come media per animale per generare l’indice di irritazione. L’indice di fototossicità si ottiene con l’equazione “Indice di irritazione del sito irradiato dagli UVA – Indice di irritazione del sito non irradiato” (42). L’indice di fototossicità superiore a 0,6 indica il potenziale di fototossicità. In alternativa, lo spessore dell’orecchio può essere misurato per stimare l’edema nei test sui topi. Questi test in vivo riflettono bene il processo fisiopatologico della fototossicità nell’uomo, ma i sacrifici degli animali, le spese e il tempo necessario per condurre il test pongono molti problemi soprattutto nell’era della consapevolezza diffusa del benessere degli animali e dell’etica. I test di fototossicità non basati sugli animali stanno guadagnando popolarità in questi giorni per superare questi problemi (43).

Metodi in chimica per la valutazione della fototossicità. Per valutare la fototossicità sono stati esplorati metodi in provetta senza cellule, cioè in chemico. Le informazioni sull’assorbanza della luce e sulla fotostabilità dell’articolo di prova sono state analizzate per prevedere la fototossicità (44). Utilizzando la generazione di specie reattive dell’ossigeno durante la fotoeccitazione e la successiva fotoreazione, il potenziale fototossico di una sostanza chimica può essere valutato in chemico (12). L’ossigeno singoletto è rilevato dallo sbiancamento della p-nitrosodimetilanilina (RNO) mentre il Nitro Blue-Tetrazolium Test (reazione NBT-formazan) è impiegato per determinare la generazione di perossido come illustrato di seguito (24),

• Ossigeno singlet + imidazolo

• → → imidazolo ossidato

• + RNO

• → sbiancamento RNO + prodotti

Il test di generazione del ROS ha mostrato una sensibilità e specificità del 90% e 76.9% per i cosmetici e 100% e 75% per i prodotti chimici non cosmetici. L’attività di rottura del filamento di DNA è un altro modo per valutare la fototossicità indotta dai raggi UV di diversi tipi di sostanze chimiche o farmaci in chimica attraverso la quantificazione del DNA circolare aperto o chiuso. Anche questo test non richiede cellule o tessuti vivi, ma plasmidi. Il plasmide viene sciolto in un tampone e mescolato con gli articoli di prova. Dopo che la miscela è stata irradiata con UV, i campioni sono sottoposti a elettroforesi. La quantità di DNA rotto viene analizzata con una tecnologia basata sulla fluorescenza. Il composto fototossico indotto dai raggi UV provoca l’apertura dei filamenti di DNA e dipende dalla concentrazione del farmaco e dalla dose di irradiazione UV (33). Questi test non richiedono cellule o tessuti vivi che possono aumentare la variabilità dei risultati. Tuttavia, questi metodi hanno delle limitazioni che includono la mancanza di capacità di attivazione metabolica, l’inapplicabilità dei materiali insolubili in acqua (oli, solidi, gel, prodotti formulati) e l’incapacità di prevedere la fotogenotossicità, la fotoallergia (fotosensibilizzazione) o la fotocarcinogenicità. Questo test è limitato all’identificazione del pericolo, non per una valutazione della potenza fototossica.