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Using NEBcutter
NEBcutter accetta una sequenza di input, che può essere incollata, prelevata da un file locale o recuperata da NCBI come file GenBank tramite il suo numero di adesione. Sono disponibili varie opzioni per selezionare la dimensione delle ORF da visualizzare e il set di enzimi di restrizione da utilizzare. Il programma calcola le posizioni di tutti i siti degli enzimi di restrizione notando quelli che potrebbero essere potenzialmente bloccati dalla metilazione sovrapposta e trova le ORF nella sequenza. Quindi visualizza un diagramma schematico della sequenza, le ORF lunghe, in base alle regole descritte nei Metodi e tutti gli enzimi di restrizione che la tagliano una sola volta. La visualizzazione iniziale mostra anche gli enzimi che possono essere utilizzati in un digest completo per escutere ogni ORF che viene visualizzato. Figura Figura11 mostra un tipico digest, in questo caso una vista lineare del plasmide pBR322. Se la sequenza originale del DNA è circolare, allora vengono offerte entrambe le visualizzazioni, lineare e circolare. Dalla visualizzazione iniziale ci sono molte opzioni per andare oltre, compresa la digestione personalizzata con enzimi di vostra scelta e varie visualizzazioni del digest. È anche possibile, dalle visualizzazioni lineari, zoomare su una regione selezionata della sequenza per una visione più dettagliata. Un’opzione permette di selezionare una particolare regione e di visualizzare gli enzimi che tagliano immediatamente adiacenti alla regione. Questo è utile per trovare enzimi in grado di tagliare la regione desiderata. Se lo zoom porta ad una regione di <60 nucleotidi allora viene visualizzata la sequenza reale (Fig. (Fig.2),2), insieme a qualsiasi traduzione che sia appropriata. Su questo display sono mostrati tutti gli enzimi che tagliano la sequenza, tutte le basi che formano parti di una sequenza di riconoscimento dell’enzima di restrizione sono evidenziate e muovendo il mouse sul nome di un enzima si produce un riquadro con la sequenza di riconoscimento annotata e la sequenza stessa diventa sottolineata nel display.
La visualizzazione lineare di un digest del plasmide pBR322. Si noti che le due ORF principali sono affiancate da siti (MseI e PflMI; BspHI e EarI) che potrebbero essere usati per escinderle dalla sequenza completa del plasmide. In questa visualizzazione sono mostrati solo gli enzimi che scindono la sequenza una volta. Le opzioni per ulteriori digestioni e visualizzazioni sono disponibili attraverso i pulsanti nella parte inferiore del display.
Visualizzazione ingrandita di una breve regione da pBR322. Si noti che le basi evidenziate in rosso e blu formano parti di siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione. Quelle rosse sono univoche, mentre quelle blu sono basi degenerate. Così BsiEI riconosce la sequenza CGRYCG. I residui CG esterni sono invarianti, mentre le basi interne sono degenerate e, nella sequenza specifica mostrata, sono GT. Le basi mostrate in nero non fanno parte di alcun sito di riconoscimento dell’enzima di restrizione. Questa visualizzazione può essere utile per trovare enzimi di restrizione in grado di distinguere gli alleli SNP.
Su qualsiasi visualizzazione principale, muovendo il mouse sul nome di un enzima di restrizione verrà mostrata la sua sequenza di riconoscimento e il numero di base preciso in cui si scinde. Se è presente più di un sito per l’enzima, tutti gli altri siti sono sottolineati. Cliccando sul nome dell’enzima si aprirà una pagina con un riassunto di informazioni sull’enzima, compresa la sua sensibilità alla metilazione, i tipi di estremità prodotte, gli isoschizomeri disponibili e un elenco di altri enzimi che possono produrre estremità compatibili. Per gli enzimi NEB, vengono fornite informazioni sulle condizioni di digestione e un link al sito web NEB.
Una caratteristica chiave di NEBcutter è che incorpora tutto ciò che è registrato in REBASE sulla sensibilità alla metilazione di qualsiasi enzima visualizzato quando si sovrappone a un sito Dam (GATC), un sito Dcm (CCWGG), un sito CpG, un sito EcoKI (AACN6GTGC) o un sito EcoBI (TGAN8TGCT). Quando vengono eseguiti digest teorici, i risultati includono un confronto degli effetti della metilazione evidenziando le bande che si spostano (Fig. (Fig.33).
Un digest teorico che mostra gli effetti della metilazione Dcm sovrapposta sui siti MscI (sequenza di riconoscimento: TGGCCA) presenti nella sequenza se il batteriofago lambda fosse stato cresciuto in un ceppo E.coli che esprime la metiltrasferasi Dcm (sequenza di riconoscimento: CCWGG). I frammenti che sono interessati dalla metilazione Dcm sono mostrati in rosso. Il gel virtuale è basato sull’interpolazione di una curva spline cubica generata da dati sperimentali prodotti con frammenti di dimensioni note.
In ogni pagina sono forniti hot link che riportano alla pagina principale, forniscono aiuto nell’interpretazione della visualizzazione o permettono agli utenti di inviare commenti agli autori. L’interfaccia è stata progettata per essere il più intuitiva possibile e per fornire un facile accesso alle principali funzioni utili ai ricercatori che cercano di scindere il loro DNA. L’attuale versione di NEBcutter ha elaborato più di 400 000 sequenze dagli utenti. Attualmente stiamo preparando una serie di miglioramenti a NEBcutter e il rilascio della versione 2.0 è previsto per il 1° luglio.