Il mantenimento della stabilità genomica è essenziale per la prevenzione della morte cellulare indebita o della neoplasia (Cassidy e Venkitaraman, 2012). Lesioni critiche del DNA, come le rotture del doppio filamento (DSB), attivano la risposta al danno al DNA (DDR) – una rete di segnalazione diffusa che coinvolge la riparazione del DNA, l’attivazione dei checkpoint del ciclo cellulare, e un’ampia modulazione dell’espressione genica e molte vie metaboliche (Ciccia e Elledge, 2010; Hiom, 2010). Le DSB sono indotte da radiazioni ionizzanti, sostanze chimiche radiomimetiche e radicali di ossigeno endogeni. Accompagnano lo stallo della forcella di replicazione e si formano e risigillano nella ricombinazione meiotica e nel riarrangiamento dei geni del recettore dell’antigene durante lo sviluppo del sistema immunitario. Le principali vie di riparazione per i DSB sono la nonhomologous end joining (NHEJ) a rischio di errore o la riparazione della ricombinazione omologa ad alta fedeltà (HRR; Holthausen et al., 2010; Lieber, 2010). L’ampia e potente rete di segnalazione evocata dalle DSB inizia con un rapido accumulo nei siti DSB di un grande gruppo di proteine soprannominate “sensori” o “moderatori” e continua con l’attivazione di diverse protein chinasi (“trasduttori”) con funzioni parzialmente ridondanti che trasmettono il segnale a numerosi effettori a valle, che sono tipicamente attori chiave nei vari rami della DDR (Lovejoy e Cortez, 2009; Ciccia e Elledge, 2010; Lukas et al, 2011).

Il principale trasduttore dell’allarme DSB è la serina-treonina chinasi ataxia telangiectasia (A-T) mutata (ATM; Banin et al., 1998; Canman et al., 1998), che si attiva in risposta all’induzione DSB (Bakkenist e Kastan, 2003) e continua a fosforilare una pletora di substrati (Matsuoka et al., 2007; Bensimon et al., 2010). ATM appartiene a una famiglia conservata di protein chinasi simili alle fosfoinositidi (PIKKs) che include, tra gli altri, altri due importanti trasduttori della DDR: la subunità catalitica della DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs) e ATR (ataxia telangiectasia e Rad3 related). Queste tre chinasi mantengono strette relazioni funzionali (Lovejoy e Cortez, 2009). Evidenze recenti suggeriscono che l’ampia capacità di ATM come proteina chinasi le permette di regolare altri processi, come i livelli di stress ossidativo (Guo et al., 2010), e giocare un ruolo nelle arene citoplasmatiche, non-DDR, tra cui l’omeostasi mitocondriale (Yang et al, 2011; Valentin-Vega e Kastan, 2012; Valentin-Vega et al., 2012).

Mutazioni germinali umane che abrogano le risposte cellulari ai danni al DNA causano gravi sindromi di instabilità genomica (Jeppesen et al., 2011). Il gene ATM è mutato nella sindrome da instabilità genomica A-T (Savitsky et al., 1995). La A-T è caratterizzata da neurodegenerazione progressiva, immunodeficienza, predisposizione al cancro, instabilità genomica e sensibilità agli agenti induttori DSB (McKinnon, 2012). La malattia è causata da mutazioni ATM nulle, e i pazienti di solito mostrano la perdita completa della proteina ATM (Gilad et al., 1996).

Gli studi dei processi ATM-dipendenti si basano tipicamente su cellule umane wild-type contro A-T, ATM knockdown utilizzando RNAi, ricostituzione di cellule ATM-deficienti mediante espressione ectopica della proteina ATM wild-type o kinase-dead, o trattando cellule coltivate con inibitori ATM. I laboratori che utilizzano questi sistemi sperimentali hanno a lungo ritenuto che le conseguenze fisiologiche della perdita di ATM in contrapposizione alla presenza di ATM inattivo potrebbero non essere simili (Choi et al., 2010). Gli articoli di Daniel et al. e Yamamoto et al. (entrambi in questo numero) forniscono solide prove di questa nozione e segnano un punto di svolta nella nostra visione della modalità di funzione di ATM. Entrambi i lavori si basano sulla manipolazione del gene Atm nel topo.

I topi knockout Atm sono stati a lungo. Questi topi mostrano la maggior parte dei sintomi di A-T, tra cui basso peso corporeo, sterilità, radiosensibilità e predisposizione al cancro, ma la neurodegenerazione è considerevolmente meno marcata in questi animali rispetto a quella osservata nei pazienti umani A-T (Barlow et al., 1996; Elson et al., 1996; Xu et al., 1996; Borghesani et al., 2000). Così, prima dell’insorgenza del cancro e senza esposizione alle radiazioni, il fenotipo Atm-/- murino è relativamente moderato. Utilizzando l’espressione del transgene Atm mutante in uno sfondo Atm-/- (Daniel et al., 2012) e tramite knockin diretto (Yamamoto et al., 2012), i due gruppi hanno generato nuovi ceppi di topi che mancano di attività Atm; piuttosto che essere privi di Atm, questi animali esprimono livelli fisiologici di proteina cataliticamente inattiva (chinasi morta). Sorprendentemente, in entrambi i laboratori, questo genotipo ha portato alla letalità embrionale precoce, con un’instabilità genomica intrinseca superiore a quella osservata negli animali Atm-/- (Fig. 1). L’espressione condizionale della proteina mutante nel sistema immunitario ha ridotto l’efficienza della ricombinazione V(D)J (variabile, diversità e giunzione) e la commutazione della classe delle immunoglobuline – due processi che coinvolgono la via NHEJ della riparazione DSB e richiedono ATM attivo per una funzione ottimale. Tuttavia, questa riduzione era paragonabile a quella causata dall’assenza di Atm. Collettivamente, i dati di entrambi i laboratori suggeriscono che il percorso HRR di riparazione DSB, piuttosto che NHEJ, può essere influenzato in misura maggiore dalla presenza di Atm inattivo rispetto all’effetto ottenuto dopo la perdita di Atm.

Questo fenotipo drammatico è presumibilmente causato da un grave malfunzionamento della DDR, attestando ancora una volta la sua importanza nel primo sviluppo. Il ruolo critico della DDR nello sviluppo è stato documentato in passato (Phillips e McKinnon, 2007), ma la novità degli studi attuali sta nella profonda differenza tra la perdita di Atm e la presenza di Atm cataliticamente inattivo: I pazienti A-T mostrano tipicamente la perdita di ATM, e nei rari casi di ATM cataliticamente inattivo nei pazienti, il suo livello è abbastanza basso da permettere la vitalità. Un’osservazione simile è stata fatta recentemente da Zhang et al. (2011) con un altro membro della famiglia PIKK-DNA-PKcs. Questo gruppo ha scoperto che i topi che esprimono una versione mutante di DNA-PKcs, priva di tre siti di fosforilazione associati alla sua attivazione, muoiono poco dopo la nascita come risultato del fallimento del midollo osseo. È interessante notare che in contrasto con questo, l’abolizione di tre siti di fosforilazione nell’Atm del topo, i cui equivalenti nell’ATM umano sono fosforilati durante la sua attivazione (Bakkenist e Kastan, 2003; Kozlov et al., 2006), non ha prodotto alcun fenotipo distinguibile (Pellegrini et al., 2006; Daniel et al., 2008).

Sembra, quindi, che la presenza di livelli fisiologici di Atm inattivo interferisca gravemente con la DDR, certamente più della sua assenza. Perché questo potrebbe essere? Anche se il meccanismo esatto di questo fenomeno è sconosciuto, si possono fare alcune ipotesi. ATM è reclutato nei siti DSB (Andegeko et al., 2001) ed è quindi presente negli enormi foci nucleari che coprono questi siti. Molte fosforilazioni mediate da ATM avvengono all’interno di questi conglomerati proteici. È importante notare che il reclutamento di Atm morto per chinasi nei siti di danno al DNA è stato trovato da Daniel et al. (2012) e Yamamoto et al. (2012) che si verifica normalmente. È possibile che la presenza di Atm cataliticamente inattivo all’interno di questi hub DDR disturbi gravemente la capacità della cellula di rispondere al danno. Presumibilmente, interferisce con la dinamica temporale ordinata degli eventi all’interno di queste fabbriche di proteine (Lukas et al., 2011). Una comprensione più profonda dell’organizzazione spaziale di questi assemblaggi proteici (Chapman et al., 2012) e la gerarchia temporale degli eventi al loro interno può chiarire il ruolo di ATM non solo come un enzima, ma anche come una parte proteica in queste strutture. Da notare che ATM è una grande proteina di 3.056 residui, di cui il ∼10% costituisce il suo sito attivo. Le funzioni di regolazione del restante 90% di questo polipeptide sono in gran parte sfuggenti. In un senso più ampio, questi studi dimostrano in modo convincente, a livello dell’organismo, che la perdita di un enzima rispetto al fatto che risiede inattivo nella cellula può essere un mondo a parte. In questo contesto, sarebbe interessante monitorare lo sviluppo di malignità in quegli animali che esprimono l’Atm mutante nel loro sistema linfoide. Questo è particolarmente importante perché i tumori maligni osservati nei topi Atm-/-, simili ai pazienti A-T, sono principalmente linfoidi.

Le implicazioni per la ricerca traslazionale legata ad ATM sono notevoli. ATM è stato naturalmente considerato un potenziale bersaglio da inattivare nelle cellule tumorali per sensibilizzarle selettivamente alla radioterapia (Begg et al., 2011; Basu et al., 2012; Golding et al., 2012). L’avvento di efficaci inibitori di ATM (Hickson et al., 2004; Golding et al., 2009) ha ulteriormente stimolato queste speranze. La buona notizia è che l’effetto di questi inibitori sulla radiosensibilità cellulare (e, probabilmente, sul benessere generale) potrebbe essere più profondo di quanto stimato in precedenza, a condizione che queste piccole molecole possano essere mirate specificamente nelle cellule maligne. D’altra parte, l’esposizione di tessuti corporei normali e proliferanti agli inibitori ATM potrebbe essere indesiderabile, a seconda del tipo di tessuto. Tale esposizione del tessuto normale all’inibizione di ATM, anche se breve, potrebbe portare a una sostanziale instabilità genomica, una potenziale forza motrice verso una nuova malignità.