Risultati

Dopo la lesione dei nervi periferici, si avvia un modello sequenziale di degenerazione assonale e degradazione della mielina, seguito da una rapida rigenerazione. Il processo infiammatorio e i suoi mediatori sono stati implicati nella regolazione di entrambi i processi degenerativi e rigenerativi assonali dopo la lesione. Uno dei mediatori infiammatori che potrebbe svolgere un ruolo importante durante questi processi è l’enzima cicloossigenasi-2 (COX-2), responsabile della metabolizzazione dell’acido arachidonico della membrana cellulare in prostaglandine, tra gli altri effetti pro-infiammatori.

COX-2 è upregolato e la produzione di prostaglandine è aumentata nei macrofagi e nelle cellule di Schwann, dopo vari tipi di lesioni dei nervi periferici. Gli studi sull’upregolazione della COX-2 durante la rigenerazione assonale si sono concentrati principalmente sulla sua partecipazione nell’induzione del dolore neuropatico, invece che sul processo di rigenerazione stesso. Tuttavia, il fatto che la COX-2 sia così fortemente upregolata dopo una lesione nervosa, e anche in grado di modulare mediatori infiammatori come le citochine pro-infiammatorie, suggerisce un ruolo importante per questo enzima anche nell’evoluzione della rigenerazione nervosa.

Celecoxib (CLX) è un inibitore selettivo della COX-2 con potenti proprietà antinfiammatorie e analgesiche. Il CLX ha mostrato proprietà neuroprotettive in modelli di ischemia cerebrale e di neurite infiammatoria sperimentale. L’uso di CLX ha anche dimostrato di essere efficace nel ridurre il dolore neuropatico in seguito a lesioni nervose periferiche nei ratti. Uno studio recente ha scoperto che l’acido acetilsalicilico, un inibitore non selettivo della COX, potrebbe accelerare il recupero funzionale dopo una lesione da schiacciamento nervoso nel ratto, anche se si ritiene che siano coinvolti altri meccanismi d’azione. Tuttavia, gli effetti di CLX sul recupero funzionale dopo una lesione del nervo periferico, per quanto ne sappiamo, non sono stati studiati prima. In questo studio abbiamo studiato gli effetti di CLX sul recupero funzionale dopo la lesione del nervo periferico utilizzando un modello di schiacciamento del nervo sciatico del ratto.

Le procedure animali sono state eseguite in conformità con l’uso corretto e la cura degli animali da laboratorio. In questo studio sono stati utilizzati 15 ratti Wistar maschi (250-300 g). Gli animali sono stati tenuti in una stanza a temperatura controllata, con un ciclo luce/buio di 12 ore, con accesso a cibo e acqua ad libitum.

Gli animali sono stati assegnati in modo casuale a 3 diversi gruppi: Sperimentale (n = 5), Controllo (n = 5) e gruppo Sham (n = 5). Nei gruppi sperimentale e di controllo, la compressione unilaterale del nervo sciatico è stata fatta come segue: Dopo l’anestesia con pentobarbital (Anestesal, Pfizer Inc, Messico) (50 mg/kg ip), una piccola incisione è fatta nella parte superiore dello stretto e i muscoli sono separati per esporre il nervo sciatico. I nervi vengono poi schiacciati con una pinza emostatica non seghettata larga 1 mm ad una forza standardizzata a livello del medio stretto per 30 secondi. Nel gruppo sham il nervo sciatico è stato esposto ma non schiacciato. In seguito il muscolo e la pelle vengono suturati separatamente, e l’animale viene lasciato a recuperare in gabbie individuali. Questa lesione da schiacciamento può essere usata come modello di assonotmesi per studiare il recupero della funzione nervosa.

Gli animali del gruppo sperimentale hanno ricevuto CLX (Celebrex®, Pfizer Inc, Messico) (10 mg/kg ip) immediatamente prima e ogni giorno per 7 giorni dopo la lesione. Il gruppo di controllo ha ricevuto una normale soluzione salina negli stessi periodi di tempo.

La valutazione dell’indice funzionale sciatico (SFI), una valutazione affidabile del recupero dei nervi, è stata effettuata in tutti gli animali nei giorni 0 (prima dell’intervento) e nei giorni 1, 7, 14 e 21 dopo l’intervento. Le zampe posteriori dei ratti sono state marcate con inchiostro nero solubile in acqua, e poi all’animale è stato permesso di camminare liberamente attraverso una passerella confinata larga 12 cm e lunga 50 cm, lasciando le sue impronte su un pezzo di carta bianca che copre il pavimento della passerella. La distanza dal tallone alla punta del terzo dito del piede e sia l’alluce che l’alluce intermedio, definiti come la distanza tra il primo e il quinto e tra il secondo e il quarto dito, rispettivamente, sono stati misurati con un’approssimazione di 0,5 mm. Sono stati valutati sia gli arti normali che quelli feriti. Abbiamo misurato 3 impronte per arto per animale erano e poi la media dei valori al fine di calcolare il SFI per ogni animale, utilizzando una formula descritta altrove. Un SFI vicino a 100 indica una grave compromissione mentre un SFI vicino a 0 è considerato normale.

Il recupero funzionale è stato anche esaminato registrando il giorno di insorgenza motoria e di deambulazione in tutti gli animali come descritto da Gold et al. Due osservatori in cieco esaminano il recupero quotidianamente, e registrano il numero di giorni che ogni animale impiega per essere in grado di raddrizzare il piede e muovere le dita (insorgenza motoria), e per camminare usando il piede e le dita dell’arto posteriore ferito (insorgenza della camminata). I valori vengono poi mediati per calcolare la media per ogni gruppo e confrontati.

Le variazioni di SFI nel tempo sono state confrontate tra i gruppi utilizzando un’analisi della varianza a 2 vie a misure ripetute (ANOVA). Quando l’ANOVA ha mostrato una differenza significativa tra i gruppi, abbiamo applicato un test Tukey post hoc per trovare la posizione della differenza. L’ANOVA a una via è stata usata per confrontare l’insorgenza motoria e la deambulazione tra il gruppo di controllo e quello sperimentale. I dati sono stati analizzati con il software statistico SPSS 11.0 (SPSS Inc. Software, Chicago, Illinois, USA), e tutti i valori sono espressi come media +/- SD e P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

Prima della chirurgia, tutti gli animali avevano valori SFI vicino a 0 (normale), e subito dopo lo schiacciamento del nervo valori superiori a 90 (gravemente compromessa), senza differenza statistica tra i gruppi. Successivamente, a partire dal giorno 1 e fino all’ultimo giorno dello studio, i ratti del gruppo sperimentale hanno mostrato un recupero significativamente più veloce rispetto al gruppo di controllo (P = 0,02, tra soggetti misure ripetute ANOVA), con test post hoc che mostrano una differenza significativa al giorno 7 (80.2 +/- 6.3 vs. 66 +/- 12.1; P = 0.04) L’insorgenza motoria e deambulatoria è stata raggiunta prima nei ratti del gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo, essendo statisticamente significativa solo per l’insorgenza motoria (11.4 +/- 1.1 vs. 13.6 +/- 1.8). Il gruppo Sham ha avuto valori SFI normali durante tutto lo studio (tabella (tabella11).

I nostri risultati mostrano che il CLX può accelerare il recupero funzionale dopo la compressione del nervo sciatico nel ratto. Tuttavia, la nostra piccola dimensione del campione e la grande SD sono debolezze statistiche del nostro studio, e l’assenza di prove istologiche o elettrofisiologiche ci impedisce di concludere che CLX ha effetti simili sulla rigenerazione assonale. È stato dimostrato che la COX-2 modula la neuroinfiammazione in vari disturbi neurologici e le citochine pro-infiammatorie sono state implicate nell’orchestrazione del processo infiammatorio che porta alla degenerazione e alla rigenerazione dopo le lesioni nervose. Una di queste citochine, il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa), è nota per indurre l’attivazione del fattore nucleare kappab (NF-kappab), un fattore di trascrizione che promuove un’ulteriore produzione di citochine pro-infiammatorie nelle cellule infiammatorie. Prove recenti hanno dimostrato che CLX può inibire l’attivazione dipendente da TNF-alfa di NF-kappaB, con conseguente forte attività antinfiammatoria. Anche i macrofagi e le cellule di Schwann svolgono ruoli essenziali nella degenerazione e nella rigenerazione assonale nei nervi periferici danneggiati e la COX-2 è sovraregolata in entrambe queste cellule durante l’infiammazione dei nervi periferici. Inoltre, l’inibizione della COX-2 ha dimostrato di inibire l’attività neurotossica dei macrofagi e delle cellule gliali nei neuroni in vitro. Se uno di questi effetti è il meccanismo responsabile dei risultati del nostro studio richiede ulteriori indagini. Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che CLX può alterare beneficamente il corso del recupero funzionale dopo la lesione del nervo periferico.