Il dogma centrale della biologia molecolare è DNA→RNA→Proteina. Per sintetizzare una particolare proteina, il DNA deve prima essere trascritto in RNA messaggero (mRNA). L’mRNA può poi essere tradotto dal ribosoma in catene polipeptidiche che costituiscono la struttura primaria delle proteine. La maggior parte delle proteine vengono poi modificate attraverso una serie di modifiche post-traslazionali tra cui il ripiegamento delle proteine, la formazione di ponti disolfuro, la glicosilazione e l’acetilazione per creare proteine funzionali e stabili. L’espressione delle proteine si riferisce alla seconda fase di questo processo: la sintesi delle proteine dall’mRNA e l’aggiunta di modifiche post-traslazionali

Impara più biologia molecolare nel nostro eBook Plasmidi 101!

I ricercatori usano varie tecniche per controllare l’espressione delle proteine per applicazioni sperimentali, biotecnologiche e mediche. I ricercatori possono visualizzare le proteine in vivo etichettandole con proteine fluorescenti per studiare la localizzazione o purificare le proteine per studiare la loro struttura, interazioni e funzioni. Le proteine possono anche essere purificate per essere usate nella ricerca di biologia molecolare (per esempio, polimerasi e altri enzimi possono essere purificati e usati per manipolare il DNA), o in medicina (per esempio l’insulina).

Le proteine, a differenza del DNA che può essere sintetizzato relativamente facilmente, devono essere prodotte usando miscele complesse derivate da cellule o usando cellule vive. Ci sono diversi tipi di sistemi di espressione utilizzati per la produzione e la purificazione delle proteine. Questi includono i sistemi di espressione dei mammiferi, degli insetti, dei batteri, delle piante, dei lieviti e delle cellule libere.

In generale la strategia generale per l’espressione delle proteine consiste nel trasfettare le cellule con il modello di DNA scelto e permettere a queste cellule di trascrivere, tradurre e modificare la proteina di interesse. Le proteine modificate possono poi essere estratte dalle cellule lisate attraverso l’uso di tag proteici e separate dai contaminanti usando una varietà di metodi di purificazione. Decidere quale sistema di espressione utilizzare dipende da diversi fattori:

1. La proteina che stai cercando di esprimere
2. Quanta proteina ti serve
3. I tuoi piani per le applicazioni a valle

In questo post del blog riassumeremo alcuni dei sistemi di espressione più comuni, compresi i loro vantaggi e i caveat da tenere a mente prima di scegliere un sistema.

Sistemi di espressione dei mammiferi

Le cellule dei mammiferi sono un sistema ideale per l’espressione delle proteine dei mammiferi che richiedono molteplici modifiche post-traslazione per il corretto funzionamento delle proteine. La maggior parte dei costrutti di DNA progettati per l’espressione nei mammiferi utilizzano promotori virali (SV40, CMV e RSV) per una robusta espressione post-trasfezione. I sistemi mammiferi possono esprimere proteine sia in modo transitorio che attraverso linee cellulari stabili. Entrambi i metodi producono alte rese proteiche se la trasfezione ha successo.

Alcuni sistemi di mammiferi permettono anche di controllare quando una proteina viene espressa attraverso l’uso di promotori costitutivi e inducibili. I promotori inducibili sono estremamente utili se un prodotto proteico desiderato è tossico per le cellule ad alte concentrazioni. Nonostante i loro vantaggi, i sistemi di espressione dei mammiferi richiedono condizioni di coltura cellulare impegnative rispetto ad altri sistemi.

Sistemi di espressione degli insetti

Le cellule degli insetti possono anche essere usate per produrre proteine eucariotiche complesse con le corrette modifiche post-traslazionali. Ci sono due tipi di sistemi di espressione degli insetti: cellule di insetto infettate da baculovirus e non litiche.

I sistemi di espressione di baculovirus sono molto potenti per l’espressione di proteine ricombinanti di alto livello. Questi sistemi permettono l’alta espressione di proteine molto complesse e glicosilate che non possono essere prodotte in cellule di E. coli o di lievito. L’unico problema con i sistemi di baculovirus è che la cellula ospite infettata alla fine viene lisata. La lisi cellulare arresta la produzione di proteine, ma ci sono sistemi di espressione di cellule di insetti non litici (sf9, Sf21, cellule Hi-5) che permettono l’espressione continua di geni integrati nel genoma delle cellule di insetti. Entrambi questi tipi di sistemi di espressione di insetti possono essere scalati per la produzione di grandi quantità di proteine.

Alcuni svantaggi dei sistemi di espressione delle cellule di insetto includono che la produzione di virus può richiedere molto tempo e che le cellule di insetto richiedono condizioni di coltura impegnative simili ai sistemi di espressione dei mammiferi.

Sistemi di espressione batterica

Quando si vuole produrre grandi quantità di proteine rapidamente ed economicamente, una cellula ospite batterica è quasi sempre la risposta. E. coli è sicuramente uno degli ospiti più popolari per l’espressione delle proteine con diversi ceppi che sono specializzati per l’espressione delle proteine. L’espressione della proteina nei batteri è abbastanza semplice; il DNA che codifica per la vostra proteina di interesse viene inserito in un vettore di espressione plasmidico che viene poi trasformato in una cellula batterica. Le cellule trasformate si propagano, vengono indotte a produrre la vostra proteina di interesse e poi lisate. La proteina può quindi essere purificata dai detriti cellulari.

Ci sono diversi vettori di DNA popolari che possono essere utilizzati per produrre grandi quantità di proteine nelle cellule batteriche: i vettori pET, pRSET, Gateway pDEST, e pBAD per esempio. L’espressione della proteina da ognuno di questi vettori è controllata da un promotore diverso che porta a diversi livelli di espressione da ogni vettore; un’espressione più bassa può essere richiesta se la tua proteina è tossica per l’E. coli. Di tutti i vettori, pET, sotto il controllo del promotore T7 lac e indotto dal lattosio, fornisce il più alto livello di espressione della proteina.

Nonostante la loro facilità d’uso, è importante notare che i batteri di solito non possono produrre proteine funzionali multidominio dei mammiferi in quanto le cellule batteriche non sono attrezzate per aggiungere modifiche post-traslazionali appropriate. Inoltre molte proteine prodotte dai batteri diventano insolubili, formando corpi di inclusione che sono difficili da estrarre senza reagenti duri e pazienza.

Sistemi di espressione vegetale

Le piante forniscono un mezzo economico e a bassa tecnologia di espressione di massa di proteine ricombinanti. Molte cellule di vari tipi di piante come il mais, il tabacco, il riso, la canna da zucchero e persino i tuberi di patate sono stati usati per l’espressione delle proteine.

I sistemi vegetali condividono molte delle stesse caratteristiche e requisiti di elaborazione dei sistemi di espressione delle cellule dei mammiferi, compresa la maggior parte delle complesse modifiche post-traslazionali. L’estrazione e la purificazione delle proteine ricombinanti dalle piante, tuttavia, possono essere costose e richiedere molto tempo, poiché i tessuti vegetali stessi sono biochimicamente complessi.

Per aggirare questi problemi, gli scienziati hanno sfruttato la secrezione naturale di sostanze biochimiche e proteine attraverso le radici delle piante. Etichettare le proteine ricombinanti con un peptide vegetale secreto naturalmente permette un accesso più facile e la purificazione di una proteina desiderata. Nonostante sia una tecnologia piuttosto nascente, le cellule vegetali sono state usate per esprimere una vasta gamma di proteine, compresi anticorpi e prodotti farmaceutici, in particolare le interleuchine.

I sistemi di espressione del lievito

Il lievito è un ottimo sistema di espressione per generare grandi quantità di proteine eucariotiche ricombinanti. Anche se molte specie di lievito possono essere utilizzate per l’espressione delle proteine, S. cerevisiae è la specie più affidabile e frequentemente utilizzata a causa del suo uso come organismo modello in genetica e biochimica.

Quando si usa S. cerevisiae, i ricercatori spesso mettono le proteine ricombinanti sotto il controllo del promotore inducibile del galattosio (GAL). Altri promotori comunemente usati includono i promotori PHO5 e CUP1 inducibili al fosfato e al rame, rispettivamente. Le cellule di lievito sono coltivate in mezzi ben definiti e possono essere facilmente adattate alla fermentazione permettendo una produzione stabile e su larga scala di proteine.

In generale i sistemi di espressione del lievito sono più facili ed economici da lavorare rispetto alle cellule di mammifero, e sono spesso in grado di modificare proteine complesse a differenza dei sistemi batterici. Le cellule di lievito, tuttavia, hanno un tasso di crescita più lento delle cellule batteriche e le condizioni di crescita devono spesso essere ottimizzate. Le cellule di lievito sono anche note per l’iperglicosilazione delle proteine, che può essere un problema a seconda della vostra proteina di scelta.

Sistemi di espressione senza cellule

Nei sistemi di espressione senza cellule, le proteine sono assemblate in vitro usando componenti purificati del macchinario di trascrizione e traduzione. Questi includono ribosomi, RNA polimerasi, tRNA, ribonucleotidi e aminoacidi. I sistemi di espressione senza cellule sono ideali per l’assemblaggio veloce di più di una proteina in una sola reazione. Un grande vantaggio di questi sistemi è la loro capacità di assemblare proteine con aminoacidi etichettati o modificati che sono utili in diverse applicazioni a valle. I sistemi di espressione senza cellule, tuttavia, sono costosi e tecnicamente molto impegnativi da usare.

Alyssa D. Cecchetelli è uno scienziato di Addgene. Ha ricevuto il suo dottorato alla Northeastern University ed è particolarmente interessata alla segnalazione e alla comunicazione cellulare. Ama essere in grado di aiutare la comunità scientifica a condividere i plasmidi.

Risorse aggiuntive

• Sistemi di espressione proteica della Thermofisher
• Espressione di proteine ricombinanti in Escherichia coli: progressi e sfide
• Produzione di proteine ricombinanti in essudati di radici di piante