Uno dei problemi più seri relativi al trattamento delle infezioni causate da C. striatum è l’isolamento di ceppi multiresistenti dal materiale clinico e la selezione della terapia antibiotica appropriata per un dato tipo di infezione. Le infezioni da C. striatum devono essere trattate in base ai risultati dei test di suscettibilità. La resistenza multipla ai farmaci è causata dall’interazione di molteplici meccanismi di resistenza che emergono attraverso l’acquisizione di determinanti di resistenza estranei o mutazioni spontanee. Questo lavoro evidenzia l’alta prevalenza di ceppi multi-resistenti e di geni di resistenza tra i C. striatum isolati in un ospedale in Tunisia, in particolare la resistenza agli aminoglicosidi, ai composti del gruppo MLSB, ai fluorochinoloni e ai β-lattami.

I 63 C. striatum analizzati in questo studio erano suscettibili alla vancomicina e al linezolid. In un precedente rapporto utilizzando il metodo della diffusione su disco, Martinez et al.19 hanno dimostrato che 31 C. striatum isolati da campioni clinici erano suscettibili alla vancomicina. Più recentemente, Gomila et al.20 hanno riportato che anche i loro 52 C. striatum isolati da pazienti con malattia respiratoria cronica ostruttiva erano suscettibili alla vancomicina. La vancomicina è ancora attiva oggi e quindi rappresenta un’opzione adeguata per il trattamento delle infezioni gravi causate da C. striatum. Anche il linezolid ha mostrato un’eccellente attività, con MIC di routine inferiori a 0,5 mg/L21. Gómez-Garcés et al.22 hanno dimostrato che vancomicina e linezolid erano ugualmente attivi contro 30 C. striatum clinici (MICs90 di entrambi i composti = 0,5 mg/L). Il linezolid può essere considerato un’alternativa alla vancomicina contro C. striatum, anche se i suoi effetti collaterali durante i lunghi cicli di trattamento richiesti per infezioni associate a hardware o dispositivi devono essere considerati. Tutti i nostri C. striatum erano sensibili alla daptomicina (MIC90 = 0,25 mg/L). È stato dimostrato che la daptomicina è attiva anche contro C. striatum, da sola23 o combinata con la rifampicina24. Pertanto, la daptomicina può anche essere considerata un’alternativa alla vancomicina per il trattamento delle infezioni da C. striatum, anche se recentemente è stata segnalata una rapida emergenza di resistenza ad alto livello alla daptomicina25, 26.

Gli aminoglicosidi sono usati come antibiotici complementari per trattare le infezioni gravi causate da difteroidi. Tra gli aminoglicosidi, l’amikacina e la gentamicina hanno mostrato una buona attività “in vitro” contro il nostro C. striatum (MICs90 = 1 e 2 mg/L, rispettivamente). La resistenza agli aminoglicosidi si verifica attraverso diversi meccanismi che possono coesistere simultaneamente nella stessa cellula. L’inattivazione enzimatica della molecola dell’antibiotico è la più diffusa nell’ambiente clinico. Il gene aac(3)-XI, che codifica un’aminoglicoside 3-N acetil transferasi che conferisce resistenza a gentamicina e tobramicina in C. striatum 27, non è stato trovato nei nostri 3 isolati resistenti alla gentamicina, suggerendo che la resistenza è mediata da un altro meccanismo. La kanamicina e la streptomicina non sono usate nella pratica clinica in Tunisia ma sono state testate in questo studio perché sono buoni marcatori per rilevare la presenza dei geni aph(3′)-Ic, aph(3″)-Ib e aph(6)-Id. Il gene aph(3′)-Ic, che codifica un’aminoglicoside-O-fosfotransferasi implicata nella resistenza a kanamicina, neomicina, paromomicina, ribostamicina e lividomicina, fa parte di una regione di DNA più grande che contiene la coppia tandem aph(3″)-Ib – aph(6)-Id dei geni di resistenza che conferiscono resistenza alla streptomicina in Corynebacterium spp28. Identiche regioni di resistenza agli aminoglicosidi sono state trovate nel plasmide pTP10 di C. striatum nelle immediate vicinanze delle regioni di resistenza all’eritromicina e al cloramfenicolo29. Come previsto, i 10 C. striatum resistenti alla kanamicina portavano il gene aph(3′)-Ic. Tuttavia, questo gene è stato rilevato anche in ceppi suscettibili alla kanamicina, probabilmente a causa di mutazioni che interessano la sua sequenza codificante o il suo promotore. Questi risultati confermano che il gene aph(3′)-Ic è diffuso in Corynebacterium spp. La resistenza alla streptomicina in Corynebacterium spp. è legata alla presenza del tandem dei geni aph(3″)-Ib e aph(6)-Id, che codificano per l’aminoglicoside-3″-fosfotransferasi e aminoglicoside-6-fosfotransferasi, rispettivamente28. Cinque degli 8 isolati resistenti alla streptomicina erano portatori dei geni aph(3″)-Ib e aph(6)-Id, e gli altri tre avevano MIC per la streptomicina nell’intervallo da 1 a 4 mg/L, probabilmente come conseguenza di mutazioni nei geni sopra menzionati o nel loro promotore. Altri meccanismi come l’efflusso attivo dell’antimicrobico e la ridotta assunzione nella cellula batterica possono contribuire alla resistenza alla streptomicina in questi isolati. L’amikacina è infine prescritta nella terapia combinata contro le infezioni gravi causate da C. striatum all’ospedale FHU. I nostri risultati indicano che l’amikacina è l’aminoglicoside preferibile per il trattamento delle infezioni da C. striatum mentre la gentamicina potrebbe essere una valida alternativa. Tuttavia, la comparsa di ceppi resistenti richiede una continua vigilanza.

Eritromicina e clindamicina erano inattive contro la maggior parte dei nostri C. striatum, in particolare la clindamicina, con una MIC90 otto volte superiore a quella dell’eritromicina. Questo fatto conferma l’alta prevalenza precedentemente riportata di resistenza ai composti del gruppo MLSB tra Corynebacterium spp., incluso C. striatum 30. MLS resistenza in Corynebacterium spp. è più spesso mediata da due meccanismi: target-site modifica mediata da RNA ribosomal metilasi codificati dai cosiddetti geni erm e farmaco attivo-efflusso mediato da una pompa di efflusso di membrana codificata dal gene mef (A-E) 31. I nostri risultati hanno confermato quelli di studi precedenti che hanno sottolineato che erm(X) è il gene più importante implicato nella resistenza MLS in Corynebacterium spp29, 32. Per la prima volta abbiamo rilevato il gene erm(B) che codifica la metilasi dell’RNA ribosomiale Erm(B) in C. striatum. Il gene erm(B) conferisce resistenza di alto livello ai macrolidi in Campylobacter coli 33 e altri patogeni rilevanti ma è eccezionale in Corynebacterium spp31, 34. Dieci dei nostri ceppi hanno portato i geni erm(B) e erm(X) contemporaneamente, una caratteristica precedentemente riportata solo in un ceppo di C. urealyticum 31.

Un terzo del nostro C. striatum ha mostrato resistenza intermedia o di alto livello alla ciprofloxacina e moxifloxacina. I fluorochinoloni sono stati utilizzati intensamente nell’ospedale FHU durante gli ultimi due decenni. Con la somministrazione di antibiotici, si crea una pressione selettiva negli organi del corpo dove i fluorochinoloni tendono ad accumularsi. L’esposizione ai fluorochinoloni seleziona mutanti spontanei in grandi popolazioni batteriche, comprese quelle che colonizzano la pelle e le mucose come i corynebacteria. Così, la resistenza al fluorochinolone è emersa in isolati clinici di C. striatum e C. amycolatum 35. La resistenza ai fluorochinoloni in Corynebacterium spp. è causata da mutazioni nel QRDR del gene gyrA. Nei nostri ceppi, singole sostituzioni aminoacidiche in posizione 87 della proteina GyrA hanno generato la resistenza alla ciprofloxacina, ma le doppie mutazioni nel gene gyrA che portano a cambiamenti nelle posizioni 87 e 91 erano necessarie per una resistenza di alto livello alla ciprofloxacina e alla moxifloxacina. In quattordici dei 21 C. striatum resistenti al fluorochinolone, gli aumenti delle MIC di ciprofloxacina e moxifloxacina fino a 16 mg/L erano legati a una doppia mutazione non conservativa nelle posizioni 87 e 91. Sierra et al.35 hanno anche riportato doppie mutazioni nelle posizioni 87 e 91 nel gene gyrA di sei dei loro C. striatum, anche se le MIC di moxifloxacina per i loro ceppi erano inferiori (6-8 mg/L). Cinque dei nostri ceppi con mutazioni singole nelle posizioni 87 o 91 sono ancora resistenti alla ciprofloxacina anche se con MIC più basse (nell’intervallo 2-8 mg/L) mentre le MIC della moxifloxacina sono rimaste a 1 mg/L. Le singole mutazioni nel residuo Ser-87 o nel residuo Asp-91 descritte da Sierra et al.35 hanno aumentato le MIC della ciprofloxacina a 1-6 mg/L, mentre rimanevano suscettibili alla moxifloxacina. Il più alto livello di resistenza alla moxifloxacina nei nostri ceppi suggerisce l’esistenza di un meccanismo di resistenza aggiuntivo alle mutazioni in gyrA. In due ceppi non sono stati rilevati cambiamenti nei loro QRDR, indicando che la resistenza era mediata da un meccanismo diverso.

Iβ-lattamici sono la classe di antimicrobici più ampiamente utilizzata. Sono stati riportati trattamenti di successo delle infezioni da C. striatum con penicillina36 o amoxicillina37 . Tuttavia, è stata comunicata una bassa suscettibilità alla penicillina e al cefotaxime tra gli altri β-lattamici10, 38, anche se il meccanismo genetico della resistenza non è stato finora caratterizzato. Considerando i valori MICs90 (16 mg/L), la penicillina e la cefotaxima hanno mostrato la stessa bassa attività contro il nostro C. striatum. Il fatto che il tasso di ceppi resistenti alla penicillina sia più alto di quello dei cefotaxime si spiega perché il breakpoint di suscettibilità CLSI per la penicillina è stato recentemente abbassato da 1 mg/l a 0,125 mg/L39. L’idrolisi degli antibiotici β-lattamici da parte delle β-lattamasi è il meccanismo più comune di resistenza per questa classe di agenti antibatterici nei batteri clinicamente importanti. Le β-lattamasi sono classificate dalla sequenza proteica in quattro classi molecolari, A, B, C e D, basate su motivi conservati e distintivi degli aminoacidi. Cinquantadue dei nostri ceppi erano resistenti alla penicillina e questa resistenza era legata alla presenza di un gene bla che codifica una β-lattamasi di classe A. I cromosomi di Corynebacterium jeikeium K41140, Corynebacterium urealyticum DSM 710941, e Corynebacterium resistens DSM 4510042, codificano le corrispondenti controparti del gene bla di C. striatum, sebbene non sia stato associato alla resistenza ai β-lattamici in queste specie. Il gene ampC, che codifica una β-lattamasi di classe C, è stato rilevato in 42 dei 52 C. striatum resistenti alla penicillina. I geni ampC, che sono ampiamente distribuiti tra le Enterobacteriaceae, codificano enzimi attivi su penicilline e cefalosporine43. Mostriamo qui che due geni codificanti β-lattamasi, bla e ampC, sono presenti in C. striatum resistente ai β-lattamici. I nostri dati hanno rivelato alti tassi di resistenza ai β-lattamici e un’alta prevalenza dei geni bla e ampC tra i C. striatum isolati nel nostro ospedale. Questi dati sono di valore per i professionisti, scoraggiando l’uso di composti β-lattamici per il trattamento delle infezioni causate da C. striatum.

PFGE è considerato il gold standard negli studi epidemiologici di microrganismi patogeni, fornendo importanti informazioni sulla loro struttura di popolazione44. I nostri risultati hanno mostrato 22 modelli PFGE distinti da 63 ceppi di C. striatum. L’alta diversità di genotipi tra i 63 C. striatum ha rivelato che non sono principalmente strettamente correlati. Pertanto, C. striatum all’ospedale FHU potrebbe provenire da diversi lignaggi e fonti invece di un’espansione di un singolo lignaggio clonale. Questo corrisponde alla condizione patogena di C. striatum come un patogeno opportunista che causa malattie occasionali in pazienti predisposti. Alcuni pattern PFGE sono stati isolati più frequentemente, suggerendo l’esistenza di alcuni cloni più prevalenti. Consideriamo i pattern E e A come pulsotipi ad alta prevalenza. La maggior parte di C. striatum assegnata ai genotipi E e A era altamente resistente, indicando che i cloni più prevalenti sono altamente resistenti, come è stato precedentemente riportato10, 16. Il fatto che molti diversi profili di resistenza agli antibiotici potessero essere distinti tra i ceppi appartenenti a un particolare modello PFGE ha rivelato che non esisteva un singolo ceppo ma diversi cloni strettamente correlati che producevano infezioni sporadiche.

In conclusione, questo studio evidenzia la rilevanza di C. striatum come un patogeno nosocomiale emergente multiresistente all’ospedale FHU. Gli isolati di C. striatum hanno mostrato il 100% di suscettibilità a vancomicina, linezolid e daptomicina e alti tassi di resistenza a rifampicina, composti del gruppo MLSB, fluorochinoloni e β-lattamici. Tra i vari cloni di C. striatum che circolano nell’ospedale FHU, i più prevalenti erano i più resistenti. Pertanto, la sorveglianza di C. striatum MDR dovrebbe essere continuata.