Miglioramento della qualità dello sperma nel seme iperviscoso dopo il trattamento con DNasi I
Abstract
L’iperviscosità dello sperma compromette la motilità dello sperma e può portare all’infertilità maschile. Questo studio prospettico mirava a valutare la capacità della DNasi esogena di migliorare la qualità dello sperma, tenendo conto che la DNasi è stata trovata nel plasma seminale di diverse specie e che i neutrofili rilasciano cromatina per intrappolare i batteri. Un totale di settantasette campioni di sperma con alta viscosità seminale (HSV) come gruppo di studio e sessantadue campioni di sperma con normale viscosità seminale (NSV) come gruppo di controllo sono stati confrontati in questa analisi. Questi campioni di sperma sono stati divisi in tre gruppi che hanno ricevuto un trattamento (a) con DNasi I a 37°C per 15 minuti, (b) mediante centrifugazione a gradiente di densità e (c) con una combinazione dei due metodi precedenti. Dopo un trattamento di quindici minuti di sperma iperviscoso, la motilità degli spermatozoi nell’83% dei campioni di sperma è aumentata in modo statisticamente significativo. Al contrario, il trattamento con DNase di sperma con viscosità normale non ha avuto tali effetti. Il trattamento di cui sopra è stato anche accompagnato da un aumento significativo della percentuale di spermatozoi normali, con conseguente importante diminuzione dell’indice di teratozoospermia. Il confronto tra i campioni di sperma sottoposti a centrifugazione in gradiente di densità dopo il trattamento con DNasi I, e quelli raccolti dopo il solo trattamento in gradiente di densità, ha mostrato che nel primo caso i risultati sono stati più spettacolari. La valutazione di ogni preparazione in termini di rendimento (% di spermatozoi totali progressivamente mobili dopo il trattamento in relazione alla conta spermatica totale iniziale) ha rivelato che l’approccio combinato ha portato al 29,8% contro il 18,5% con il solo trattamento di densità (p=0,0121). Il trattamento con DNase I risulta in un miglioramento della motilità e morfologia dello sperma e potrebbe essere vantaggioso per gli uomini con sperma iperviscoso nei protocolli di riproduzione assistita.
1. Introduzione
Gli studi hanno documentato che l’iperviscosità seminale (SHV) si verifica nel 12-29% degli eiaculati. La SHV è una condizione che può portare all’infertilità maschile, in quanto può compromettere seriamente le caratteristiche fisiche e chimiche del liquido seminale. È stata associata a una ridotta motilità degli spermatozoi, nonché a un cattivo risultato nella fecondazione in vitro e a una maggiore produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Inoltre, i livelli di prodotti di danno ossidativo seminale sono stati significativamente correlati con la viscosità del liquido seminale nei maschi infertili.
Ci sono forti indicazioni dell’esistenza di percorsi inibitori che compromettono la qualità dello sperma attraverso la produzione di ROS durante il trasporto di sperma attraverso il tratto genitale maschile, indicazioni di danni allo sperma durante la manipolazione e la conservazione in laboratorio, ma anche indicazioni di produzione supplementare di ROS “automaticamente” dopo l’eiaculazione, almeno in alcuni casi di iperviscosità seminale. Questa condizione è per lo più associata all’infezione delle ghiandole sessuali accessorie maschili e al varicocele, anche se la fisiopatologia non è ancora completamente compresa. Inoltre, la ridotta capacità antiossidante del liquido seminale è stata rilevata in campioni oligoastenozoospermici nei casi di iperviscosità seminale. Inoltre, i livelli eccessivamente generati di ROS generano una perossidazione lipidica che altera la morfologia della membrana. La presenza di livelli aumentati di leucociti nello sperma è associata alla SHV. Inoltre, i leucociti sono una fonte importante di ROS e i vettori di retrovirus nello sperma, mentre la loro presenza è stata associata con una minore probabilità di concepimento, nonché un tasso di successo inferiore di inseminazione intrauterina (IUI) e di FIV convenzionale. Inoltre, SHV è correlato con la composizione del microbiota seminale e la maggiore prevalenza di batteri patogeni.
Sono stati proposti diversi approcci terapeutici per ridurre la viscosità del seme SHV. L’iperidratazione e il massaggio prostatico non sono stati efficaci. L’aspirazione e l’espulsione delicata dello sperma, attraverso una siringa da 5 ml, sono quasi inefficaci perché la SHV non è un fenomeno meccanico. La proteolisi attraverso l’uso della chimotripsina migliora il trattamento del seme iperviscoso, anche se si verificano alcune alterazioni nelle proteine dello sperma. Prendendo in considerazione che tale procedura può danneggiare la struttura dello sperma e che nella maggior parte dei casi la SHV è correlata alla leucocitospermia, abbiamo ipotizzato che la SHV sia causata dalle trappole extracellulari dei neutrofili (NETs) e che siano sensibili alla degradazione del DNA attraverso la DNasi I. Per quanto ne sappiamo questo è il primo rapporto di utilizzo della DNasi I, per affrontare la SHV.
2. Materiali e metodi
2.1. Partecipanti
Uno studio prospettico è stato condotto per 3 anni in pazienti con una storia di infertilità presso la Clinica Medica di Atene, Locus Medicus, con i seguenti criteri di esclusione: ipogonadismo varicocele, criptorchidismo e ostruzione congenita dei dotti seminali. Settantasette campioni di sperma con HSV sono stati ottenuti come gruppo di studio e sessantadue campioni di sperma normale con NSV sono stati ottenuti come gruppo di controllo, stratificato come segue. Inizialmente, un set di trentadue campioni di sperma di HSV e dieci campioni di sperma di NSV sono stati trattati con DNase I. Inoltre, un altro set di ventisei campioni di sperma HSV e cinquantadue di NSV sono stati trattati con il metodo della centrifugazione a gradiente di densità (DGC). Infine, diciannove campioni di HSV sono stati trattati con una combinazione dei metodi, cioè, trattamento iniziale con DNase I, seguita da DGC. Tutti i partecipanti hanno firmato un modulo di consenso informato prima di qualsiasi coinvolgimento.
2.2. Analisi dello sperma
I campioni di sperma, ottenuti tramite masturbazione dopo un’astinenza sessuale di 3-5 giorni, sono stati posti in contenitori sterili. Dopo la raccolta, i campioni di sperma sono stati lasciati liquefare a 37°C e poi sono stati sottoposti ad analisi convenzionali limiti di riferimento analisi dello sperma, prima e dopo il processo combinato descritto sopra]. La motilità è stata valutata dallo stesso biologo ufficialmente formato (ESHRE), non coinvolto nello studio. La presenza di globuli bianchi (WBC) è stata valutata con il test della perossidasi (Leukoscreen FertiPro; Belgio) secondo le linee guida OMS 2010. Anche se la viscosità potrebbe essere valutata tramite viscosimetro quantitativo, la viscoelasticità dello sperma è stata stimata utilizzando pipette di plastica monouso che hanno permesso allo sperma di cadere per gravità e osservando la lunghezza di qualsiasi filo. Gli uomini il cui sperma ha una lunghezza del filo tra 2cm e 4cm sono classificati con SHV lieve (53,12%); una lunghezza del filo tra 4cm e 6cm (40,62%) è etichettata come SHV moderata; e una lunghezza del filo superiore a 6cm è diagnosticata come SHV grave (6,25%) sono stati inclusi nel gruppo ad alta viscosità (HV), mentre la viscoelasticità è stata considerata normale quando la lunghezza del filo era di 2 cm o meno .
2.3. Trattamento con enzima
L’effetto della DNasi I è stato valutato in campioni di sperma normale e ad alta viscosità. Dopo la liquefazione, la DNasi I è stata prelevata delicatamente nel contenitore sterile con il campione di sperma ad una concentrazione finale di 20 U/ml e mescolata costantemente seguita da un’incubazione a 37°C per un tempo compreso tra 15 e 60 minuti. La motilità e la morfologia dei campioni di sperma di cui sopra sono stati analizzati prima e dopo la digestione enzimatica e la % di spermatozoi PR (motilità di (a+b) % della conta totale degli spermatozoi) prima di qualsiasi trattamento è stata valutata (cioè, % PR iniziale).
2.4. Preparazione dello sperma
Il metodo di centrifugazione a gradiente di densità (DGC) è stato fatto secondo le raccomandazioni del produttore. Il gradiente di densità viene preparato stratificando 1 ml di mezzo al 40% sopra il mezzo all’80% PureSperm® (Nidacon International, Gothenburg, Svezia) in una provetta da centrifuga conica da 15 ml. Lo sperma è stato stratificato sulla parte superiore del gradiente e centrifugato a 300g per 20 minuti. L’estensione e la forza della centrifugazione possono essere variate a seconda della qualità del campione: per esempio, il tempo di centrifugazione può essere aumentato per i campioni ad alta viscosità. Dopo la centrifugazione, la maggior parte del surnatante deve essere rimosso delicatamente e il pellet posto in una nuova provetta pulita e risospeso bene in 5 ml di mezzo per rimuovere il mezzo di gradiente di densità. Viene poi centrifugato a 200g per 10 minuti, il surnatante viene rimosso e il pellet finale viene risospeso nel mezzo sterile per le tecnologie di riproduzione assistita (ART). Infine, nel trattamento combinatorio, i campioni ad alta viscosità sono stati inizialmente trattati con DNasi I e poi preparati con il metodo DGC sopra descritto. Sono state determinate la concentrazione, la motilità e la morfologia prima e dopo la preparazione.
Considerando che la conta totale degli spermatozoi progressivamente mobili (TPMSC) dopo il lavaggio potrebbe essere utile per prevedere l’efficacia dell’inseminazione intrauterina, la resa di ciascun metodo è stata valutata come segue: la percentuale di TPMSC dopo il trattamento con la preparazione DGC o con DNase I o con il trattamento combinato DNase I seguito dalla preparazione DGC è stata divisa per il numero di spermatozoi totali prima del trattamento. Inoltre, il risultato della resa (cioè, % PR finale/spermatozoi totali prima) è stato confrontato con la % PR iniziale/spermatozoi totali prima di qualsiasi trattamento. La resa è stata valutata in campioni di sperma con viscosità alta o normale. Anche se non c’è consenso sul numero di spermatozoi mobili somministrati nella ART, è generalmente accettato che il recupero del numero massimo di spermatozoi mobili di ogni campione di sperma dopo qualsiasi trattamento è di grande importanza.
2.5. Analisi statistica
I dati sono stati analizzati mediante ANOVA a una via seguita dal test di confronto multiplo Kruskal-Wallis utilizzando GraphPad Prism 6.0. Un valore p inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
La concentrazione di globuli bianchi (WBC) è mostrata nella Figura 1. C’è una differenza statisticamente significativa tra tutti i gruppi (p=0,0238 ANOVA a una via). Inoltre, la differenza statistica all’interno del gruppo HV è 0,0018.
Concentrazione di WBC (106/ml) secondo la lunghezza del filo di viscosità (lieve, moderata e grave) come gruppo HV; w/o V: sperma senza viscosità.
L’uso della DNasi I aumenta la motilità degli spermatozoi negli uomini (32 soggetti) con alta viscosità. Come mostra la Figura 2(a), l’aggiunta dell’enzima per quindici minuti (t=15) migliora la percentuale di (a) movimento dal 2,875% di spermatozoi all’8,094% di spermatozoi subito dopo la liquefazione (t=0) che è statisticamente significativa (p=0,049, test di confronto multiplo). Inoltre, il movimento della PR tra gli stessi punti temporali è aumentato dal 27,468% ad un statisticamente significativo 46,59% (p<0,0001, test di confronto multiplo). Allo stesso tempo, la motilità della frazione (c) è diminuita dal 34,687% (t=0) al 21,5% (t=15) (p<0,0001, test di confronto multiplo) mentre la motilità della frazione (d) è diminuita dal 37,812% (t=0) al 31,968% (t=15) (p=0,45 test di confronto multiplo). L’uso della DNasi I nello sperma con viscosità normale non aumenta la motilità degli spermatozoi in modo statisticamente significativo, in nessun campione, come illustrato nella Figura 2(b).
(a)
(b)
(a)
(b)
Effetti della DNasi I nella motilità dello sperma dopo 15 minuti di incubazione con DNasi I. La DNasi I migliora il movimento del PR in modo statisticamente significativo nello sperma iperviscoso (a) ma non ha alcun effetto nello sperma con viscosità normale (b). w/o: sperma senza trattamento, trattato: sperma trattato con DNase I, a: spermatozoi rapidamente progressivi, b: spermatozoi lentamente progressivi, c: non progressivi, d: immotili, e PR: motilità di (a+b).
La continuazione dell’incubazione per altri quindici minuti (in 21 soggetti su 32) (per un tempo totale di trenta minuti, t=30) ha aumentato la motilità di una frazione di spermatozoi al 9,524% (t=30) da 1,761% (t=0) (p=0,046, test di confronto multiplo) come dimostrato nella Figura 3. È interessante notare che il movimento PR è migliorato drasticamente dal 24% (t=0) al 45,047% (t=30) (p<0,0001, test di confronto multiplo) degli spermatozoi. La motilità della frazione (c) e (d) degli spermatozoi è diminuita in modo statisticamente significativo dal 35,714% al 22,08% (p=0,001, test di confronto multiplo) e dal 40,238% al 32,238% (p=0,039, test di confronto multiplo), rispettivamente. La rivalutazione della viscosità dello sperma dopo il trattamento con DNase I ha mostrato che nella maggior parte dei casi la viscosità è stata normalizzata o almeno migliorata.
Effetti della DNase I nella motilità del seme iperviscoso dopo 30 minuti di incubazione con DNase I. La DNasi I migliora il movimento in modo statisticamente significativo nel seme iperviscoso ma in modo meno spettacolare rispetto all’incubazione di quindici minuti. w/o: sperma senza trattamento, trattato: sperma trattato con DNase I, a: spermatozoi rapidamente progressivi, c: non progressivi, d: immotili, e PR: motilità di (a+b).
Abbiamo poi confrontato i risultati dello sperma sottoposto a centrifugazione in gradiente di densità dopo trattamento con DNase I, con quelli trovati dopo il solo trattamento in gradiente di densità. A causa dei limiti dei campioni, le due procedure non sono state utilizzate su campioni provenienti dagli stessi soggetti, ma su campioni provenienti da soggetti diversi la cui viscosità dello sperma era elevata. Il trattamento di centrifugazione a gradiente di densità è stato impiegato anche per l’inseminazione intrauterina (IUI). Come illustrato nella Figura 4, la percentuale di (a) movimento dopo la centrifugazione a gradiente di densità in seguito al trattamento con DNasi I è aumentata dal 3,416% al 35,083% degli spermatozoi (un miglioramento di 10,27 volte) rispetto al 6,333% al 26,866% degli spermatozoi (un miglioramento di 4,242 volte) nel caso del solo trattamento a gradiente di densità (p<0,0001, test Kruskal-Wallis a confronto multiplo). Per quanto riguarda il movimento (b), dopo la centrifugazione in gradiente di densità dopo il trattamento con DNasi I, il miglioramento è stato anche statisticamente significativo (dal 28,583% al 40,916% degli spermatozoi (un aumento di 1,43 volte), p=0,0112). Nel gruppo di trattamento con centrifugazione a gradiente di densità, il rispettivo miglioramento è aumentato dal 34,533% al 46,466% degli spermatozoi (un miglioramento di 1,34 volte) anche se la differenza tra i gruppi non era statisticamente significativa (ns, confronto multiplo test Kruskal-Wallis). Inoltre, il movimento della PR nel primo gruppo è aumentato dal 32% al 76% degli spermatozoi (2,375 volte) rispetto a un miglioramento di 1,776 volte nel secondo gruppo (dal 40,866% al 72,666% degli spermatozoi) (non statisticamente significativo tra i gruppi, test Kruskal-Wallis a confronto multiplo). La motilità della frazione (c) e (d) degli spermatozoi è diminuita dal 36,083% al 10,583% e dal 31,916% al 13,583%, rispettivamente. La rispettiva diminuzione nel gruppo di trattamento con centrifugazione a gradiente di densità da solo è stata dal 29,40% al 14,80% (non statisticamente significativo tra i gruppi, test Kruskal-Wallis a confronto multiplo).
Confronto tra DGC dopo trattamento DNase I vs DGC da solo nella motilità del seme iperviscoso. Il trattamento combinatorio ha avuto un impatto maggiore sul movimento degli spermatozoi rispetto al solo DGC. w/o: sperma senza trattamento, trattato: sperma trattato con DNase I, a: spermatozoi rapidi progressivi, b: spermatozoi lenti progressivi, c: non progressivi, d: immotili, e e PR: motilità di (a+b).
Si è valutato il TPMSC postlavaggio in relazione al numero iniziale (rendimento) di ogni preparazione (M&M). La resa del trattamento a gradiente di densità nel caso di un individuo senza viscosità del seme è stata del 27,096% (Figura 5, w/o V-d). La resa della stessa preparazione nel caso di individui con alta viscosità (Figura 5, HV-d) è stata del 18,519%. Il cambiamento in entrambi i casi rispetto al rispettivo controllo (cioè, Figura 5, w/o V, HV) era statisticamente significativo (p<0,0001 e p=0,0377, rispettivamente, test di confronto multiplo Kruskal-Wallis) che denota che molti spermatozoi PR sono stati persi dopo il trattamento DGC. Quando gli spermatozoi degli individui con alta viscosità sono stati sottoposti al trattamento con DNase (Figura 5, HV-DNase), la resa corrispondente è stata del 42,47% mentre il confronto tra il trattamento con gradiente di densità (HV-d) e il trattamento con DNase (HV-DNase) ha dato come risultato un p<0,0001 rispetto al gruppo HV, test Kruskal-Wallis a confronto multiplo. Nonostante la grandezza del risultato di cui sopra, la combinazione di trattamento DNase che è seguita da trattamento gradiente di densità (Figura 5, HV-DNase-d) risultati per rendere 29.782% (p = 0.0121 rispetto al gruppo HV, confronto multiplo Kruskal-Wallis test). Inoltre, la preparazione combinata (HV-DNase-d) è stata confrontata con la % di spermatozoi PR nello sperma ad alta viscosità prima di qualsiasi trattamento (Figura 5, HV), e ha dato come risultato p=0,448 che significa che la maggior parte degli spermatozoi PR sono stati recuperati. Inoltre, rispetto al gruppo w/oV-d non vi è alcuna differenza statisticamente significativa come p=0,619 test di confronto multiplo Kruskal-Wallis.
Valutazione della resa % (TPMSC dopo il trattamento/spermatozoi totali prima del trattamento) di DGC, trattamento DNase, e la loro combinazione, in sperma con alta o normale viscosità. w/oV-d: sperma con viscosità normale dopo DGC, HV-d: sperma con alta viscosità dopo DGC, HV-DNase: sperma con alta viscosità dopo trattamento DNase, e HV-DNase-d: sperma con alta viscosità dopo trattamento DNase, seguito da DGC. w/oV: sperma con viscosità normale prima del trattamento; HV: sperma con alta viscosità prima del trattamento.
In seguito, la valutazione della morfologia degli spermatozoi dopo un’incubazione di quindici minuti con DNase I risulta in un aumento statisticamente significativo della percentuale di spermatozoi normali dal 5,468% al 7,25%, p=0,0197, come illustrato nella Figura 6. Allo stesso tempo, le anomalie della testa sono diminuite dall’81,75% al 74,937% (p=0,0004) mentre le anomalie del collo sono diminuite dal 22,062% al 19,343% (p=0,0197). Le anomalie della coda e la goccia citoplasmatica seguono lo stesso schema. Come risultato di queste alterazioni della morfologia, è ragionevole osservare un impatto importante sull’indice di teratozoospermia (TZI). Come illustrato nella Figura 6, esso è diminuito da 1,205 a 1,084 (p<0,0001).
L’incubazione di quindici minuti con DNase I ottimizza la morfologia degli spermatozoi e il TZI del seme ad alta viscosità. w/o: sperma senza trattamento, trattato: sperma trattato con DNase I, testa abn: anomalie della testa, coda abn: anomalie della coda, e TZI: indice di teratozoospermia.
4. Discussione
In questo studio, abbiamo ipotizzato che l’iperviscosità del seme abbia origine dai NET. I dati presentati mostrano che la digestione del DNA estruso dei NET è fattibile, portando ad un miglioramento della motilità degli spermatozoi. La digestione enzimatica del DNA del plasma seminale è stata esaminata al fine di aumentare la motilità degli spermatozoi, rendendoli così adatti all’uso in ART. L’uso della DNasi I dopo la liquefazione degli spermatozoi ha portato ad un miglioramento sia della motilità che della morfologia degli spermatozoi. Sono stati utilizzati diversi punti di incubazione per ottenere i migliori risultati, che sono stati ottenuti dopo 15 minuti di incubazione. L’obiettivo dello studio era il miglioramento della resa dell’inseminazione intrauterina, nella coorte di uomini subfertili il cui sperma è caratterizzato da un’alta viscosità molto probabilmente dovuta all’ostacolo causato dal DNA estruso. Inoltre, l’uso della DNasi I ha migliorato la morfologia anormale che di solito coesiste con l’alta viscosità. L’arricchimento dello sperma è stato valutato anche in base al numero finale di spermatozoi isolati, sia rapidi che lenti progressivi.
Il miglioramento statisticamente significativo della morfologia degli spermatozoi dopo il trattamento con DNase I può suggerire che queste anomalie si materializzano dopo l’eiaculazione e vengono mantenute a causa dell’alta viscosità. Considerando che lo sperma iperviscoso ha una ridotta capacità antiossidante totale, la presenza di spermatozoi in questo ambiente può indurre perossidazione lipidica e danni al DNA e, infine, compromissione della morfologia. Almeno alcune di queste anomalie morfologiche si sono dimostrate reversibili con il trattamento DNase I. Questo miglioramento suggerisce l’applicazione ottimale del trattamento di cui sopra nei casi in cui non vi è una domanda così elevata per un gran numero di spermatozoi direttamente mobili, come nel caso di inseminazione intrauterina, ma dove vi è la domanda per la migliore morfologia possibile, come è il caso sia di IVF o la procedura ICSI per la fecondazione .
I nostri risultati rivelano che l’applicazione di DNasi I è efficace solo in presenza di iperviscosità. Come mostra la Figura 2(b), in assenza di iperviscosità, l’uso della DNasi I non lo fa. In particolare, in condizioni di viscosità normale e indipendentemente dalla motilità degli spermatozoi, la digestione dell’enzima non ha prodotto alcuna differenza statisticamente significativa in nessuno dei parametri esaminati. Al contrario, nella coorte di sperma iperviscoso, l’uso dell’enzima ha determinato un miglioramento della motilità dei PR in modo statisticamente significativo, come mostrato nella Figura 2(a). Inoltre, non ci sono state differenze nella motilità degli spermatozoi e nel recupero della morfologia nel gruppo HV secondo la viscosità grave o moderata, sebbene il numero di campioni di sperma con viscosità grave fosse basso. Inoltre, come mostrato nella Figura 5, la differenza statisticamente significativa dopo la preparazione DGC tra il gruppo ad alta viscosità (HV-d) e il gruppo a viscosità normale (w/oV-d) è 0,0179, il che suggerisce che il miglioramento è raggiungibile. Inoltre, nella stessa figura, la resa del trattamento combinato (HV-DNase-d) ha portato al recupero di una percentuale di spermatozoi PR, che ha raggiunto il livello degli spermatozoi corrispondenti negli uomini con alta viscosità (HV) prima del trattamento, in quanto la percentuale finale di PR (29,782%, HV-DNase-d) nel primo caso non ha alcuna differenza statistica dal PR iniziale (26,478%, HV prima del trattamento), p=0,4480. La significatività di questo approccio combinato, sebbene diminuisca la resa rispetto al solo trattamento con DNasi (p<0001 tra HV-d e HV-DNase), è stata avvalorata dal fatto che il trattamento con gradiente di densità ha sottratto dalle controparti spermatozoi recuperati, (c) e (d) di classe, purificandoli. Al contrario, la differenza statistica corrispondente tra la resa della preparazione DGC (HV-d, 18,519%) e “HV prima del trattamento” (26,478%) era significativa (cioè, p=0,0322).
Inoltre, potrebbe sostituire il trattamento meccanico del seme iperviscoso; così viene comunemente diluito o aspirato in un ago ipodermico e forzato per superare l’elevata viscosità. Anche se è improbabile che questi metodi siano efficaci perché questo tipo di trattamento aumenta la produzione di ROS. Inoltre, l’iperviscosità è correlata negativamente con l’integrità della cromatina come decondensazione difettosa, che è già stato notato .
In generale, l’applicazione di DNasi I nel tratto respiratorio è già stato approvato medicalmente dalla FDA nel caso della fibrosi cistica . Inoltre, la DNasi è un componente naturale del plasma seminale il cui ruolo è probabilmente la diluizione dei NET formati nella via riproduttiva femminile dopo il reclutamento di neutrofili in risposta all’infiammazione, e la procedura proposta è potenzialmente applicabile a livello medico nella ART. Il suo ruolo è anche rafforzato dal fatto che la sua assenza ha effetti negativi sull’inseminazione dei primati.
L’iperviscosità è probabilmente causata dall’infiammazione o da qualsiasi disfunzione delle ghiandole seminali, anche se il meccanismo esatto non è chiaro. Potrebbe essere associata a infezioni virali del tratto genitale come precedentemente dimostrato dal nostro laboratorio. Diversi protocolli terapeutici sono stati applicati al fine di ridurre la viscosità del seme, ma raramente i risultati sono stati incoraggianti. Metodi come l’idratazione eccessiva e il massaggio prostatico non hanno dato i risultati previsti. L’uso di enzimi proteolitici come l’alfa-cimotripsina ha dato risultati speranzosi, ma il suo uso non è stato adottato.
In un altro studio, la DNasi I è stata utilizzata per diminuire la viscosità, ma i risultati finali non hanno avuto successo in questo senso. Gli autori non hanno studiato i parametri qualitativi dello sperma, cioè la motilità. Inoltre, il tempo di incubazione era molto più alto (un’ora) di quello da noi proposto (quindici minuti), quindi l’impatto neutro sulla viscosità potrebbe essere attribuito all’incubazione prolungata dell’enzima con il plasma seminale.
Infine, nonostante i dati che l’iperviscosità seminale è stata correlata all’infiammazione del tratto genitale maschile, cioè vescicole seminali, che ha portato all’uso di antibiotici e antiossidanti, queste forme di terapia potevano trattare questa condizione solo nei casi in cui il fattore principale era l’infiammazione. Di solito, è causata da diversi fattori che agiscono sinergicamente e quindi non esiste una terapia causale diretta per l’iperviscosità.
In seguito all’esposizione a stimoli infiammatori, i neutrofili, la principale popolazione di leucociti nel seme, esercitano il loro ruolo protettivo attraverso l’inattivazione dei batteri per fagocitosi e la successiva uccisione attraverso l’esposizione a enzimi proteolitici e ROS. Una seconda modalità di azione con cui i neutrofili possono neutralizzare gli agenti patogeni è attraverso la produzione di trappole extracellulari per neutrofili (NETs). Le NET sono reti tridimensionali fibrose, costituite principalmente da cromatina, che possono intrappolare e immobilizzare i microrganismi. Le reti hanno dimostrato di essere sensibili alla DNasi ma non alla degradazione della proteasi. Poiché la formazione dei NET è basata sul DNA e la DNasi seminale ha dimostrato di digerire il DNA estruso e di liberare gli spermatozoi aggrovigliati, abbiamo ipotizzato che l’uso di DNasi esogena potrebbe rivelarsi un valido trattamento nei casi di iperviscosità seminale causata principalmente dalla presenza di DNA extracellulare ed esposto dei neutrofili.
Dalla prospettiva della fisiopatologia, il concetto che attribuisce l’iperviscosità all’infiammazione è stato quasi stabilito. Le reazioni infiammatorie comprendono la formazione di NET dai neutrofili per l’intrappolamento dei microrganismi. È molto probabile che gli spermatozoi consumino molta energia nel tentativo di liberarsi dai NET e di conseguenza lo studio del loro stato di ossidazione e apoptotico è di grande importanza. Inoltre, l'”effetto trappola” che è già stato descritto è una conseguenza della prevenzione del movimento degli spermatozoi a causa del loro intreccio con le reti.
In questo studio, abbiamo cercato di lisare il DNA extracellulare del plasma seminale, che è il principale componente delle reti, con la DNasi I al fine di liberarli dalle reti e recuperare i parametri di qualità degli spermatozoi, cioè la motilità e la morfologia. Inoltre, come mostra la Figura 1, esiste una differenza statisticamente significativa tra la concentrazione di WBC e il grado di viscosità. Il trattamento proposto si limita alla fase di post eiaculazione e non a quella clinica. Inoltre, l’ipotesi iniziale che l’aumento della viscosità dello sperma fosse il risultato della presenza di DNA nel seme è stata verificata, anche se sono necessari ulteriori studi per confermare questa ipotesi. Prendendo in considerazione che i neutrofili reclutati formano NET in siti infiammati, abbiamo ipotizzato che il DNA nello sperma provenga dai neutrofili. Anche se non abbiamo presentato una prova diretta che supporti questa ipotesi, riteniamo che, secondo le nostre conoscenze, la principale fonte possibile di DNA sia la cromatina dei neutrofili che viene estrusa sotto l’infiammazione.
5. Conclusioni
I risultati del nostro studio supportano la conclusione che il trattamento con DNase I fornisce un miglioramento statisticamente significativo nella motilità e morfologia dello sperma. Mette a posto i parametri spermatici fondamentali per l’ART, cioè la motilità e la morfologia, solo nel caso di sperma iperviscoso. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che una causa principale di SHV è la formazione di NETs e quindi proponiamo il potenziale terapeutico e l’utilità di questo approccio.
Data Availability
I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono disponibili dall’autore corrispondente su richiesta.
Approvazione etica
Tutte le procedure eseguite in questo studio e che hanno coinvolto partecipanti umani sono state conformi alle norme etiche della Commissione di Bioetica e Deontologia, Università Nazionale Kapodistriana di Atene, Facoltà di Medicina, approvate nel gennaio 2014 (numero di riferimento: 1130).
Consenso
Tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato prima del loro coinvolgimento nello studio.
Conflitti di interesse
Tutti gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Contributi degli autori
Angelos D. Gritzapis e Vassilis Tsilivakos hanno concepito lo studio. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, e Vassilis Tsilivakos hanno eseguito l’acquisizione dei dati, hanno partecipato alla sua progettazione e hanno redatto il manoscritto. Effrosyni Nosi ha eseguito i test immunologici e Angelos D. Gritzapis ha eseguito l’analisi statistica. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti e Vassilis Tsilivakos hanno partecipato all’analisi e interpretazione dei dati. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale del manoscritto.
Riconoscimenti
Questo progetto è stato finanziato dal Laboratorio di Diagnostica Clinica, Locus Medicus S.A.