Frequently Asked Questions (FAQ) about Lentiviral Plasmids

What is the difference between 2nd generation and 3rd generation lentiviral systems?

Per una descrizione completa dei lentivirus di seconda e terza generazione, si prega di rivedere 2nd vs 3rd generation sopra. In breve, i sistemi lentivirali di seconda generazione usano più proteine HIV (su meno plasmidi) per produrre particelle lentivirali funzionali rispetto ai sistemi di terza generazione.

• Sistemi di imballaggio di seconda generazione: esprimono i geni HIV gag, pol, rev e tat da un singolo plasmide di imballaggio come psPAX2.
• Sistemi di imballaggio di terza generazione: esprimono gag e pol da un plasmide di imballaggio e rev da un altro, come pMDLg/pRRE e pRSV-Rev. I sistemi lentivirali di terza generazione sono considerati più sicuri dei sistemi di seconda generazione, ma possono essere più difficili da usare perché richiedono la trasfezione con quattro plasmidi separati per creare particelle lentivirali funzionali.

IMPORTANTE : Un plasmide di trasferimento di terza generazione può essere usato con un sistema di imballaggio di seconda generazione, ma un plasmide di trasferimento di seconda generazione non può essere usato con un sistema di imballaggio di terza generazione.

Qual è la differenza tra un lentivirus e un retrovirus?

I lentivirus sono un sottotipo di retrovirus. Da un punto di vista sperimentale, la principale differenza tra i lentivirus e i retrovirus standard (γ-retrovirus) è che i lentivirus sono in grado di infettare tipi di cellule che non si dividono e che si dividono attivamente, mentre i retrovirus standard possono infettare solo tipi di cellule attive mitoticamente. Questo significa che i lentivirus possono infettare una maggiore varietà di tipi di cellule rispetto ai retrovirus.

Sia i lentivirus che i retrovirus standard usano i geni gag, pol ed env per il packaging; tuttavia, sono virus diversi e quindi usano isoforme leggermente diverse di questi componenti di packaging. Pertanto, i lentivirus possono non essere confezionati in modo efficiente dai sistemi di confezionamento retrovirali, e viceversa.

Quale ceppo batterico dovrebbe essere usato per clonare e produrre i miei plasmidi lentivirali?

A causa delle lunghe ripetizioni terminali che si trovano nei plasmidi lentivirali, si consiglia di usare un ceppo che riduce la frequenza di ricombinazione omologa delle regioni instabili, come Invitrogen Stbl3™ o NEB Stable cells. Questo assicurerà che le ripetizioni saranno mantenute e spesso si traduce in una maggiore resa di DNA. Tuttavia, se il plasmide contiene una cassetta Gateway contenente il gene ccdB, è necessario un ceppo di sopravvivenza ccdB.

Quale linea cellulare dovrebbe essere usata per produrre lentivirus?

Le cellule 293T sono solitamente usate per produrre lentivirus. La linea cellulare 293T può essere ottenuta da GenHunter.

Cosa determina la gamma di cellule ospiti lentivirali (tropismo)?

Il tropismo lentivirale è determinato dalla capacità della proteina dell’involucro virale di interagire con i recettori sulla superficie delle cellule ospiti. La proteina dell’involucro VSV-G è comunemente usata nella produzione di particelle lentivirali perché conferisce un ampio tropismo su una gamma di specie e tipi di cellule. Per ulteriori informazioni, vedere l’articolo di Cronin, et al. sui diversi envelope e il loro tropismo.

Come si possono usare i lentivirus per fare linee cellulari stabili?

I lentivirus possono essere usati per fare linee cellulari stabili nello stesso modo dei retrovirus standard. Cioè, molti genomi lentivirali hanno marcatori selezionabili, come il gene della resistenza alla puromicina, che conferiscono resistenza agli antibiotici alle cellule ospiti infettate. Quando questi antibiotici vengono aggiunti al mezzo di crescita delle cellule ospiti, uccidono tutte le cellule che non hanno incorporato il genoma lentivirale e quelle cellule che sopravvivono possono essere espanse per creare linee cellulari stabili, che hanno incorporato il genoma lentivirale e ospitano le informazioni genetiche codificate da quel genoma.

Molti plasmidi lentivirali di trasferimento non hanno marcatori selezionabili che conferiscono resistenza a un antibiotico, ma codificano un altro marcatore, come GFP. Un ricercatore può usare FACS per ordinare le cellule che esprimono GFP e successivamente espandere queste cellule in una linea cellulare.

Dove si integrano i lentivirus?

Studi su tutto il genoma dell’integrazione virale hanno dimostrato che i lentivirus si integrano più spesso nei geni attivamente trascritti, e che questa preferenza è conservata nelle specie bersaglio. Anche se la disponibilità della cromatina facilita l’integrazione, non spiega la preferenza dei lentivirus per i geni trascritti. Gli studi che confrontano il lentivirus HIV e il retrovirus MMLV indicano che l’integrasi virale gioca un ruolo nel modellare le preferenze del sito di integrazione. Un importante determinante cellulare è LEDGF/p75, una proteina di collegamento lentivirale che recluta il complesso di pre-integrazione alle unità trascrizionali e facilita l’integrazione. I siti di legame LEDGF/p75 sono arricchiti nei corpi genici e per lo più assenti nei promotori e nelle regioni intergeniche, rispecchiando i modelli di integrazione lentivirale.

I plasmidi lentivirali possono essere usati in trasfezioni dirette invece di creare virus?

Alcuni (ma non tutti) plasmidi lentivirali di trasferimento possono essere usati in trasfezioni transitorie per ottenere l’espressione del transgene, e quelli che possono essere usati sono principalmente costrutti di terza generazione. I plasmidi lentivirali di trasferimento non sono progettati specificamente per trasfezioni transitorie. Pertanto, ci può essere limitata espressione del transgene a causa delle LTR lentivirali. Anche se possibile, non è esplicitamente raccomandato l’uso di plasmidi di trasferimento lentivirali per trasfezioni semplici.

È possibile esprimere cDNA da un plasmidi lentivirali di trasferimento normalmente utilizzati per l’espressione shRNA?

Sì, è possibile, ma prima il promotore all’interno del plasmide di trasferimento deve essere modificato. La maggior parte dei plasmidi lentivirali che esprimono shRNA, come pLKO.1, usano un promotore U6 o H1 per guidare la trascrizione diretta da RNA pol III degli shRNA. L’espressione del cDNA richiede RNA pol II, e quindi richiede un promotore RNA pol II, come CMV o RSV.

Quali tecniche possono essere usate per clonare un inserto in un plasmide lentivirale contenente un solo sito di restrizione?

Se un plasmide di trasferimento lentivirale contiene un solo sito di restrizione, si possono usare tecniche di clonazione standard per legare l’inserto in questo sito. Se non è immediatamente fattibile digerire e clonare l’inserto da un vettore genitore, alcuni approcci possibili per utilizzare questo sito includono il subclonaggio o l’aggiunta di siti di restrizione compatibili sull’inserto di interesse usando la PCR. Il processo di subclonazione consiste nel digerire l’inserto di interesse dal suo vettore genitore e nel legarlo in un secondo vettore in modo tale che l’inserto possa essere successivamente digerito da questo nuovo vettore e clonato nel vettore lentivirale. Questo è fondamentalmente mischiare i siti di restrizione tra i vettori fino a quando il gene di interesse è affiancato da siti compatibili con quelli del vettore in cui si vuole infine legare l’inserto. Spesso è meno dispendioso in termini di tempo e più facile aggiungere semplicemente i siti di restrizione sull’inserto di interesse usando la PCR. Questo si ottiene amplificando per PCR la sequenza dell’inserto usando primer che contengono i siti di restrizione necessari. I siti di restrizione funzionali devono trovarsi a un certo numero di basi dalle estremità dei primer usati. In alternativa, si potrebbe legare un sito di clonazione multipla (MCS) da un vettore separato nel singolo sito nel vettore lentivirale e generare più siti di restrizione utili.

Per ulteriori informazioni sulla clonazione e la modifica di un MCS, visitare Addgene Plasmid Reference and Protocol Guide.

Come faccio a clonare il mio inserto in un vettore di trasferimento senza siti di restrizione utili ma compatibile con il sistema di clonazione Gateway®?

I vettori compatibili con Gateway® utilizzano la ricombinazione per generare cloni contenenti l’inserto di interesse. In breve, l’inserto viene prima clonato in un vettore di ingresso in una regione fiancheggiata da sequenze (chiamate attP1 e attP2) che permettono all’inserto di ricombinarsi con il vettore di destinazione (in questo caso il vettore di destinazione sarebbe il vettore di trasferimento lentivirale). Il vettore di destinazione contiene sequenze attB con cui le sequenze attP si ricombinano. Visita il sito web di Invitrogen per ulteriori informazioni sul sistema di clonazione Gateway®.

Quali problemi di sicurezza circondano l’uso dei vettori lentivirali?

Come notato dal NIH, i due principali problemi di sicurezza che circondano l’uso dei lentivirali sono:

1. Il potenziale per la generazione di lentivirus compatibili con la replicazione
2. Il potenziale per l’oncogenesi

Il potenziale per la generazione di lentivirus compatibili con la replicazione è affrontato dalla progettazione dei vettori e dalla pratica di laboratorio sicura. In termini di progettazione dei vettori, i sistemi lentivirali di seconda e terza generazione forniti da Addgene separano i componenti di trasferimento, inviluppo e imballaggio del virus su vettori diversi. Il vettore di trasferimento codifica il gene di interesse e contiene le sequenze che si incorporeranno nel genoma della cellula ospite, ma non può produrre particelle virali funzionali senza i geni codificati nei vettori di envelope e packaging. A meno che non si verifichi una ricombinazione tra i vettori di confezionamento, busta e trasferimento, e il costrutto risultante sia confezionato in una particella virale, non è possibile per i virus normalmente prodotti da questi sistemi replicarsi e produrre più virus dopo l’infezione iniziale. A questo proposito, i sistemi di terza generazione sono considerati più sicuri dei sistemi di seconda generazione perché il vettore di impacchettamento è stato diviso in due plasmidi separati (risultando in un sistema di quattro plasmidi in totale). Inoltre, i sistemi di 3a generazione non utilizzano la proteina tat dell’HIV per produrre virus di lunghezza completa dal vettore di trasferimento durante la fase di produzione virale.

Molti dei vettori di trasferimento lentivirali che sono stati depositati presso Addgene sono vettori autoinattivanti (SIN). Questi vettori hanno una delezione nella 3’LTR del genoma virale che viene trasferita nella 5’LTR dopo un giro di trascrizione inversa. Questa delezione abolisce la trascrizione del virus completo dopo che è stato incorporato in una cellula ospite.

Il potenziale di oncogenesi è in gran parte basato sull’inserto specifico contenuto nel vettore di trasferimento lentivirale (a seconda che sia o meno un oncogene) e dovrebbe essere considerato caso per caso.

La biosicurezza dovrebbe sempre essere considerata in relazione alla natura precisa degli esperimenti che vengono eseguiti, e il tuo ufficio di biosicurezza può fornire maggiori informazioni sulle migliori pratiche della tua istituzione per quanto riguarda la ricerca lentivirale. Il NIH ha ulteriori informazioni sulle considerazioni sulla sicurezza dei lentivirali.