ABSTRACT

Prima della legatura, ogni frammento Okazaki sintetizzato sul filamento ritardatario negli eucarioti deve essere elaborato nucleoliticamente. La scissione nucleasica avviene nel contesto delle strutture di lembi 5′ generate attraverso la sintesi di dislocamento dei filamenti da parte della DNA polimerasi delta. Almeno tre nucleasi del DNA: Rad27 (Fen1), Dna2, e Exo1, sono state implicate nell’elaborazione dei lembi del frammento Okazaki. Tuttavia, né i contributi delle singole nucleasi alla sintesi dei lagging-strand né la struttura degli intermedi del DNA formati in loro assenza sono stati chiaramente definiti in vivo. Impoverendo condizionatamente le nucleasi di lagging-strand e analizzando direttamente i frammenti Okazaki sintetizzati in vivo in S. cerevisiae, conduciamo una valutazione sistematica dell’impatto di Rad27, Dna2 e Exo1 sulla sintesi di lagging-strand. Troviamo che Rad27 elabora la maggior parte dei lembi di lagging-strand, con un significativo contributo aggiuntivo di Exo1 ma non di Dna2. Quando la scissione della nucleasi è compromessa, osserviamo una riduzione della sintesi di strand-displacement in contrasto con la generazione diffusa di lunghi frammenti Okazaki 5′ lembi, come previsto da alcuni modelli. Inoltre, usando costrutti limitati dal ciclo cellulare, dimostriamo che sia l’elaborazione nucleolitica che la legatura dei frammenti Okazaki possono essere disaccoppiati dalla replicazione del DNA e ritardati fino a dopo che la sintesi della maggior parte del genoma è completa.