Negli esseri umani, circa 5 a 8 litri di aria passa dentro e fuori del polmone al minuto a riposo. L’aria può variare nella concentrazione di ossigeno e CO2, può portare allergeni, e conferisce diversi gradi di allungamento meccanico delle vie aeree e delle superfici di scambio dei gas. Questi segnali sono percepiti, trasmessi ed elaborati in output fisiologici come il controllo della pressione sanguigna polmonare, le risposte immunitarie e il ritmo della respirazione, ma il meccanismo non è chiaro. Le cellule neuroendocrine polmonari (PNEC) si trovano in una vasta gamma di organismi, dai pesci ai mammiferi (1). Nel polmone dei mammiferi, le PNEC sono le uniche cellule epiteliali delle vie aeree innervate e rappresentano meno dell’1% della popolazione totale delle cellule epiteliali polmonari (2). Anche se le prove in vitro hanno implicato le PNEC nel rilevamento dell’ossigeno, nel tono della muscolatura liscia bronchiale e vascolare e nelle risposte immunitarie (1, 3), questi ruoli non sono stati dimostrati in vivo. Uno studio recente ha dimostrato che l’ablazione genetica delle PNEC nell’adulto non ha compromesso l’omeostasi o la riparazione delle vie aeree, lasciando in dubbio l’importanza in vivo di queste cellule (4). Patologie PNEC, in particolare un aumento del numero di PNEC, sono stati documentati in una vasta gamma di malattie polmonari, tra cui l’asma, displasia broncopolmonare, fibrosi cistica, malattia polmonare ostruttiva cronica, ernia diaframmatica congenita, iperplasia neuroendocrina dell’infanzia, sindrome della morte improvvisa del lattante, e ipertensione polmonare (5-8). In ogni caso, rimane poco chiaro se l’aumento delle PNEC è una causa o la conseguenza dei sintomi.

Nel polmone del topo, la maggior parte delle PNEC risiedono in gruppi di ~ 3 a 20 cellule chiamati corpi neuroepiteliali (NEB) (3, 9). Sia le PNEC solitarie che quelle a grappolo contengono vescicole dense, piene di neuropeptidi bioattivi come il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) o ammine come la serotonina (1). Questi vengono rilasciati in risposta a stimoli, come i cambiamenti nel livello di ossigeno. I neuropeptidi e le amine sono stati implicati in alcuni degli stessi processi delle PNEC (10-12), sollevando la possibilità che possano mediare la funzione delle PNEC. Tuttavia, un nesso causale non è stato dimostrato in vivo.

Abbiamo iniziato lo studio attuale per scoprire i meccanismi alla base dell’ernia diaframmatica congenita (CDH), un difetto di nascita associato a notevoli disfunzioni polmonari, tra cui un’elevata risposta immunitaria e ipertensione polmonare (13). In un modello genetico di topo di CDH, abbiamo scoperto un difetto di clustering PNEC fallito. Questo è seguito da una sequenza di eventi: un aumento dei neuropeptidi PNEC, un aumento degli infiltrati immunitari, e il rimodellamento della struttura polmonare. Questi risultati offrono una dimostrazione in vivo della funzione PNEC. Poiché i cambiamenti nel numero PNEC e neuropeptidi associati sono stati documentati in molte malattie polmonari, i nostri risultati hanno ampie implicazioni oltre CDH.

Negli esseri umani, mutazioni nel recettore rotatorio (ROBO) geni sono stati associati con CDH (13, 14). Per studiare i difetti polmonari associati con CDH, abbiamo inattivato sia Robo1 e Robo2 in epitelio endoderma-derivato, tra cui il polmone, utilizzando Shhcre (di seguito Shhcre;Robo mutante) nei topi (15, 16). Anche se questi mutanti sopravvivono, mostrano una ridotta superficie di scambio di gas a partire dal giorno postnatale (P) 15 (Fig. 1, A e B, e fig. S1). Abbiamo eseguito microarray seguita da quantitativa reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) a P7, prima della riduzione della superficie di scambio di gas. Quindici dei primi 20 geni differenzialmente espressi sono stati implicati nelle risposte immunitarie, e tutti sono significativamente aumentati, tra cui Ccl3, Cxcl2, Tnfa, e Saa3 (Fig. 1C). Coerentemente con questa firma, abbiamo osservato un numero elevato di cellule immunitarie, tra cui neutrofili, eosinofili, macrofagi e cellule T (Fig. 1, D ed E, e fig. S2). Inoltre, c’è un aumento della proporzione di M2 e una diminuzione della proporzione di macrofagi M1 (fig. S3). Questi risultati indicano che Shhcre; mutanti Robo mostrano una maggiore sensibilità immunitaria, imitando una comorbidità comune CDH (13).

Anche se Robo è espresso nella regione alveolare del mesenchima polmonare (fig. S4), la sua espressione nell’epitelio è limitata a rare cellule lungo le vie aeree (fig. 1F). Colabeling con l’anticorpo CGRP ha rivelato che Robo-espressione delle cellule epiteliali sono PNECs (Fig. 1G). Per confermare che i geni Robo sono necessari all’interno PNECs per la funzione, abbiamo inattivato Robo utilizzando Ascl1creERT2 (17), un knock-in cre driver che conferisce PNEC-specifica attività nell’epitelio polmonare (fig. S5). Abbiamo trovato che Ascl1creERT2;Robo mutanti esposto sia semplificazione alveolare e aumento macrofagi, ricapitolando il Shhcre; Robo fenotipi (fig. S6). Questi risultati insieme dimostrano che Robo è richiesto specificamente in PNECs per limitare il numero di cellule immunitarie e prevenire la semplificazione alveolare.

Al giorno embrionale (E) 13.5, appena specificato PNECs erano cellule solitarie sia nel controllo e Shhcre; Robo polmoni mutanti (Fig. 2, A e B). Da E15.5, una maggioranza di PNECs aveva aggregato in NEBs nel controllo. Tuttavia, PNEC non erano raggruppati in Shhcre; mutanti Robo (Fig. 2, C e D). Questo fenotipo altamente penetrante persisteva nei polmoni postnatali (Fig. 2, E e F, e fig. S7). Numero totale delle cellule PNEC appare inalterato, come sostenuto dalla normale espressione di Ascl1 e altri marcatori PNEC (fig. S8). Le cellule non raggruppate nel mutante perdono la loro forma a cuneo e sono più arrotondate (figg. S7 e S9). Inoltre, in contrasto con i controlli, dove PNEC solitari non sono innervati (9), ~ 33.3% (31 di 93 cellule) di PNEC unclustered sono innervati nel mutante (Fig. 2F e fig. S9), suggerendo che l’innervazione PNEC non dipende dalla formazione di cluster o sulla funzione Robo in PNECs.

Ascl1creERT2;Robo mutanti mostrano anche PNEC unclustering (fig. S10). Questo fenotipo si è manifestato anche quando l’inattivazione Robo è stato indotto postnatale, che è successivo alla formazione NEB. Insieme, i nostri risultati stabiliscono che Robo è richiesto per l’assemblaggio PNEC e la manutenzione in NEBs.

Robo può funzionare sia in modo dipendente o indipendente dal suo ligando, Slit (18). L’analisi dei mutanti Slit mostra che, mentre il raggruppamento PNEC non è influenzato in nessuno dei singoli mutanti, è ridotto nei mutanti Slit1;3 (fig. S11, da A a D). Questo risultato suggerisce che la funzione Robo in questo processo è probabilmente ligando dipendente.

Slit e Robo funzione principalmente per mediare la repulsione cellulare e raramente attrazione (19). Per determinare se Slit agisce come un segnale repulsivo o attrattivo per le PNEC che esprimono Robo, abbiamo prima determinato dove i geni Slit sono espressi. Combinato Slit1;2-GFP (proteina fluorescente verde) reporter ha rivelato l’espressione solo in circa 1 a 3 PNEC all’interno di grandi NEBs, sollevando la possibilità che le cellule Slit1/2-espressione può essere le cellule nucleanti del cluster (fig. S11E). Questo indica anche PNEC sottospecializzazione all’interno di un cluster. L’espressione di Slit3 è limitata allo strato di cellule muscolari lisce vascolari che circondano le arterie, che corre lungo i bronchi principali dove si trovano la maggior parte delle NEB (fig. S11, F e G). Insieme, la stretta vicinanza delle cellule che esprimono Slit alle PNEC che esprimono Robo ha sollevato la possibilità che i ligandi Slit possano fornire una traccia attraente per le PNEC.

Per testare questo, le PNEC ordinate in citometria a flusso GAD1-GFP+ sono state seminate nella camera superiore di un inserto per la migrazione delle cellule di Boyden. Quando la proteina Slit è stata aggiunta con le cellule nella camera superiore, ~ 52% in meno (P = 8.5 × 10-4) PNECs migrato verso il basso (fig. S12, J a I). Al contrario, quando la proteina Slit è stato aggiunto alla camera inferiore, 18% in più (P = 7,5 × 10-5) PNECs migrato verso il basso (fig. S11, L a N). Questi risultati suggeriscono che Slit-Robo guidare clustering PNEC in NEBs, probabilmente attraverso attrazione cellulare.

Per verificare un possibile legame tra PNECs e risposta immunitaria, abbiamo testato l’espressione dei neuropeptidi prodotti da PNECs (1). Dei nove geni neuropeptidi testati, cinque sono stati significativamente up-regolati in Shhcre;Robo mutanti (Fig. 3A). Colorazione con anticorpo contro CGRP ha rivelato che, anche se la sua espressione rimane in PNECs nel mutante, l’intensità di colorazione è aumentato e non è più limitato al lato basale di queste cellule (figg. S7 e S9). Notiamo anche che, mentre unclustering si è verificato da E15.5, neuropeptide up-regolazione è osservato solo dopo la nascita, presumibilmente dopo l’esposizione all’aria (fig. S12).

Per determinare se l’aumento dei neuropeptidi contribuisce alla risposta immunitaria, ci siamo concentrati su CGRP perché la sua trascrizione mostra il più grande aumento tra tutti i testati (Fig. 3A). Abbiamo contrastato questo aumento allevando un allele mutante di Cgrp nello sfondo Shhcre;Robo (20). Nei controlli Robo, la perdita di Cgrp non ha alterato il numero di macrofagi (Fig. 3, B, D, e F). Tuttavia, in Shhcre; mutanti Robo, la perdita di Cgrp significativamente diminuito il numero di macrofagi in modo dose-dipendente (Fig. 3, C, E, e F). Abbiamo anche trovato che la perdita di Cgrp parzialmente invertito il fenotipo semplificazione alveolare (fig. S13). Notiamo che né l’aumento dei macrofagi né la semplificazione alveolare sono stati interamente impediti, suggerendo che l’aumento di altri neuropeptidi può aggiungere ai risultati a valle. Insieme, questi risultati forniscono la dimostrazione genetica in vivo che i neuropeptidi mediano la funzione PNEC.

Come alveologenesi normale inizia a P4 (21), la comparsa tardiva di semplificazione alveolare a P15 suggerisce che l’interruzione di alveologenesi non può essere una causa primaria. Anche se nessun cambiamento nella morte cellulare è stato osservato da P10, c’era una chiara riduzione di elastina (fig. S14), che è un possibile innesco di semplificazione (22). Le cellule immunitarie come i macrofagi esprimono metalloproteinasi di matrice che degradano l’elastina (23). Inoltre, l’aumento dei macrofagi è osservato prima della semplificazione (figg. S1 e S2), sollevando la possibilità di una relazione causale. Per testare questo, abbiamo trattato Shhcre;Robo e polmoni di controllo con clodronato, un farmaco idrofilo che impoverisce i macrofagi (24). Il trattamento a partire da P5, prima dell’aumento delle cellule immunitarie, ha efficacemente limitato il numero di macrofagi alveolari a livello basale in Shhcre; mutanti Robo (Fig. 4, da A a E). Questo ha attenuato la diminuzione di elastina e completamente impedito la semplificazione (Fig. 4, da F a J, e fig. S15). Insieme questi dati offrono la dimostrazione in vivo che gli infiltrati immunitari aumentati sono responsabili della semplificazione alveolare e che entrambi sono conseguenze a valle della disfunzione PNEC.

In questo studio, presentiamo prove genetiche in vivo che dimostrano che le PNEC, nonostante la loro rarità, hanno profondo impatto sulla funzione polmonare postnatale. Anche se il difetto delle PNEC è già evidente a E15.5 nel mutante Shhcre;Robo, i risultati fisiologici, a partire dalla up-regolazione dei neuropeptidi, inizia dopo la nascita. Questo suggerisce che l’effetto di PNEC dipende dall’esposizione polmonare all’aria. Così, i nostri risultati delineano una modalità di trasduzione del segnale in cui le PNEC sono reostati sensibili sulla parete delle vie aeree che traducono spunti ambientali non-cellulare-autonomamente in risposte immunitarie.

I nostri risultati stabilire Robo1,2 come un insieme di geni che controllano PNEC raggruppamento in NEBs. Presenta anche Slit e Robo come attori nell’ordinamento selettivo delle cellule nell’epitelio di un organo di mammifero. L’inattivazione di Robo dopo la formazione dei NEB ha anche portato al disaccorpamento, suggerendo che i cluster sono attivamente mantenuti. Anche se Slit-Robo sono in gran parte noti per mediare la repulsione cellulare, i nostri dati indicano che guidano il raggruppamento di PNEC attraverso l’attrazione cellulare. L’inattivazione di Robo ha portato ad un’alterazione dell’innervazione e alla perdita della localizzazione basale dei neuropeptidi. Questi cambiamenti possono essere alla base dell’alterato impatto a valle di PNECs.

Un aumento del numero di PNEC è stato documentato in una vasta gamma di malattie associate ai polmoni, che vanno da disturbi rari come CDH a condizioni comuni come l’asma (5-8). Notiamo che il fenotipo PNEC mutante Robo è distinto dall’aumento del numero di PNEC. Tuttavia, entrambi sono associati con aumento dei neuropeptidi, che mostriamo essere potenti effettori della funzione PNEC. I nostri risultati quindi prevedere che piuttosto che essere una lettura passiva della malattia, le patologie documentate PNEC e aumenti neuropeptidi possono servire come contribuenti attivi ai sintomi in una vasta gamma di malattie respiratorie.