Risultati e discussione

Caspasi-3 e caspasi-7 mostrano un’attività differenziale verso substrati sintetici.

Caspasi-3 e caspasi-7 sono entrambe attivate universalmente durante l’apoptosi, indipendentemente dallo specifico stimolo che avvia la morte, ed entrambe le proteasi sono ampiamente considerate per coordinare la fase di demolizione dell’apoptosi attraverso la scissione di una diversa serie di substrati proteici (1, 2). Tuttavia, il contributo relativo di queste proteasi alla demolizione cellulare rimane ampiamente speculativo. La caspasi-3 e la caspasi-7 sono più strettamente correlate tra loro, rispetto alle altre caspasi dei mammiferi, ma mostrano comunque una sostanziale divergenza di sequenza, con un’identità di sequenza complessiva del 56% e una somiglianza di sequenza del 73% (Fig. 1A). Per esplorare le preferenze del substrato di queste caspasi in modo più dettagliato, abbiamo espresso entrambi gli enzimi come proteine His-tagged in batteri e li abbiamo purificati fino all’omogeneità (Fig. 1B). Entrambe le caspasi sono state titolate sul sito attivo contro DEVD-AFC in combinazione con l’inibitore della policaspasi zVAD-fmk (Fig. 1C). Sulla base dei dati di titolazione del sito attivo, la concentrazione attiva di ogni enzima è stata normalizzata per consentire confronti diretti tra questi enzimi in esperimenti successivi (Fig. 1D). Abbiamo poi confrontato queste caspasi in termini di capacità di idrolizzare un pannello di substrati tetrapeptidici sintetici. Come illustra la Fig. 1E, entrambe le caspasi hanno scisso preferenzialmente DEVD-AFC con efficienza essenzialmente identica. Al contrario, la caspasi-3 ha scisso LEHD-AFC in modo più efficiente della caspasi-7, suggerendo che queste proteasi possiedono attività distinte verso alcuni substrati sintetici (Fig. 1E).