Tipo I isoenzima

Come è evidente dalla Fig. 1, l’esochinasi serve come porta attraverso la quale il Glc entra in vie metaboliche alternative. Tuttavia, è probabilmente sicuro dire che l’esochinasi è più comunemente pensato come un enzima glicolitico, e il metabolismo glicolitico è generalmente considerato un processo citoplasmatico. È stato quindi notevole che, a differenza di altri enzimi glicolitici, l’attività dell’esochinasi (ora noto per essere l’isozima TypeI) è stato trovato prevalentemente in “frazioni particellari” di brainhomogenates (Crane e Sols, 1953). Lavori successivi (Johnson, 1960; Rose e Warms, 1967; vedi anche Wilson, 1995) hanno dimostrato che l’esochinasi particolata era associata ai mitocondri, e più specificamente, alla membrana mitocondriale esterna (Rose e Warms, 1967; Kropp e Wilson, 1970), 1992; Sui e Wilson, 1997) ed è inserita nel nucleo idrofobico della membrana mitocondriale esterna nel corso del legame (Xie e Wilson, 1988). La porina (chiamata anche `VDAC,’ l’acronimo di `canale anionico voltaggio-dipendente’) forma il canale attraverso il quale i metaboliti attraversano la membrana mitocondriale esterna, ed è stata identificata come la proteina di membrana outermitocondriale che interagisce con l’esochinasi (Felgner et al., 1979; Lindén et al., 1982; Fiek et al., 1982). Inoltre, ci sono prove a sostegno del fatto che il legame dell’esochinasi si verifica in modo preferenziale alla porina che si trova nei siti di contatto, regioni in cui c’è un contatto intimo tra le membrane mitocondriali interne ed esterne (Dorbani et al., 1987; Kottke et al, 1988; BeltrandelRio e Wilson, 1992a).

Gli studi classici di Johnson (1960) e di Rose e Warms (1967) furono presto seguiti da segnalazioni di esochinasi legata a livello mitocondriale in altri tessuti normali, oltre che nel cervello, e in varie cellule tumorali (per riferimenti, vedi Wilson, 1985, 1995). Il potenziale significato fisiologico di questa associazione di un enzima glicolitico con gli mitocondri, il sito primario per il metabolismo ossidativo, è stato oggetto di molte speculazioni. Fin dall’inizio, e in particolare dopo il riconoscimento che la “proteina legante l’esochinasi” della membrana mitocondriale esterna era identica alla porina, e quindi che l’esochinasi potrebbe essere posizionata vicino al punto in cui l’ATP esce dai mitocondri (e l’ADP rientra nei mitocondri), La speculazione era in gran parte incentrata sulla possibilità che questa vicinanza potesse favorire un’intima interazione metabolica tra la fosforilazione ossidativa intramitocondriale come fonte di substrato ATP e la fosforilazione del Glc da parte dell’esochinasi legata al mitocondrio. Questo era stato considerato da Rose e Warms (1967), ma non poteva essere supportato dai loro risultati sperimentali. Tuttavia, il lavoro successivo di altri (di nuovo, per i riferimenti vedere Wilson, 1985, 1995), usando esochinasi legata al mitocondrio da varie fonti, ha prodotto prove a sostegno dell’opinione che l’esochinasi legata al mitocondrio avesse un accesso “preferenziale” o “privilegiato” all’ATP generato intramitocondrialmente.

Il lavoro nel nostro laboratorio ha fornito una solida base per l’opinione che l’esochinasi legata ai mitocondri cerebrali che fosforilano attivamente è infatti strettamente accoppiata a un compartimento intramitocondriale di substrato ATP, generato dalla fosforilazione ossidativa. Il supporto sperimentale per questa conclusione è stato descritto in una serie di pubblicazioni (BeltrandelRio e Wilson, 1991, 1992a, b; de Cerqueira Cesar e Wilson, 1995, 1998, 2002; Hashimoto e Wilson, 2000). Una revisione completa di questo lavoro non è possibile nei limiti del presente contesto, ma evidenzieremo alcuni dei principali risultati per dimostrare la varietà di approcci sperimentali, che portano tutti alla stessa conclusione, che sono stati utilizzati in questi studi.

Gli studi iniziali (BeltrandelRio e Wilson, 1991, 1992a, b) sono stati fatti usando metodi spettrofotometrici in cui la produzione di ATP da vari processi intramitocondriali (fosforilazione ossidativa, adenilato kinasereazione, reazione della creatina chinasi) e la fosforilazione del Glc da parte dell’esochinasi erano collegati alla produzione di NADPH, monitorata a 340 nm, mediante l’uso di enzimi di accoppiamento appropriati. L’idea di base era che confrontando il tasso di Glcfosforilazione con il tasso di produzione di ATP da varie fonti, onemight dedurre l’importanza relativa dei vari processi intramitocondriali generatori di ATP come fonte di substrato ATP per esochinasi. E la conclusione fu che, quando si verificava la fosforilazione ossidativa, né l’adenilato chinasi né la creatina chinasi erano una fonte significativa di substrato ATP. Inoltre, solo una frazione dell’ATP prodotto dalla fosforilazione ossidativa veniva utilizzato dall’esochinasi, con il risultato che nel mezzo extramitocondriale continuava ad aumentare man mano che la fosforilazione ossidativa continuava. Il tasso di fosforilazione del Glc non è aumentato costantemente in risposta all’aumento continuo dell’ATP extramitocondriale, tuttavia, nonostante il fatto che quest’ultimo fosse paragonabile al Km per l’ATP visto con l’aggiunta di ATP extramitocondriale in assenza di fosforilazione ossidativa, cioè l’esochinasi non sarebbe stata “satura” con l’ATP extramitocondriale come substrato (Fig. 2). Questo suggerisce fortemente che non era l’ATP extramitocondriale ad essere usato come substrato.

Un ulteriore supporto per questo è stato fornito da risultati come quelli mostrati in figura 3. Qui, Glcphosphorylation è stato monitorato dopo l’inizio della fosforilazione ossidativa con l’aggiunta di ADP, con concentrazioni crescenti di ATP extramitocondriale presente dall’inizio. Come previsto dalla classica Michaelis-Mentenkinetics, il tasso iniziale di fosforilazione Glc è aumentato con l’aumento dell’Extramitocondriale. Tuttavia, con il tempo, un tasso di stato stazionario di Glcfosforilazione è stato raggiunto che era indipendente dalla quantità di ATP residuaxtramitocondriale presente. Questi risultati sono stati interpretati come indicando che, mentre l’esochinasi legato mitocondriale inizialmente utilizzato Extramitocondriale ATP, l’inizio della fosforilazione ossidativa ha portato a aswitch nella preferenza del substrato, con esochinasi diventando dipendente da un compartimento intramitocondriale di ATP in cui è stato determinato dal tasso di fosforilazione ossidativa e indipendente dal extramitochondrial.

Anche se la produzione di ATP è iniziata quasi immediatamente dopo l’inizio della fosforilazione ossidativa con l’aggiunta di ADP, c’era un marcato ritardo nell’inizio della fosforilazione di Glc da parte dell’esochinasi legata al mitocondrio (Fig. 3D) prima del raggiungimento di un tasso di stato stazionario che persisteva per un lungo periodo. Questo periodo di ritardo iniziale è stato interpretato come il tempo necessario per riempire un compartimento intramitocondriale con ATP generato dalla fosforilazione ossidativa e da cui l’esochinasi legata al mitocondrio ha attinto il suo substrato ATP. L’inibizione del trasporto di elettroni con l’aggiunta di KCN ha portato al rilascio apparente di ATP, presumibilmente dal compartimento intramitocondriale, e le proprietà di questo “compartimento” (cinetica di riempimento, collegamento alla produzione intramitocondriale di ATP, ecc.) erano in soddisfacente accordo con le aspettative basate su questa interpretazione (BeltrandelRio e Wilson, 1991, 1992a, b). Sfortunatamente, l’accordo con le aspettative non è una guida infallibile alla verità, e l'”apparente rilascio di ATP” è stato successivamente scoperto essere un artefatto (Laterveer et al., 1993), la cui fonte non è ancora compresa e che non poteva essere riprodotta in lavori successivi (deCerqueira Cesar e Wilson, 1998). Nonostante questa sconfortante e imbarazzante battuta d’arresto, il concetto di base dell’accoppiamento dell’esochinasi legata a livello mitocondriale a un compartimento intramitocondriale di ATP è stato supportato da altre prove e ha resistito a successivi test sperimentali.

Un doppio metodo di etichettatura isotopica è stato sviluppato come alternativa alle procedure spettrofotometriche (deCerqueira Cesar e Wilson, 1995). Il Glc marcato con 14C è stato usato come substrato per l’esochinasi, e il 32Pi ha fornito un substrato per la sintesi di ATP mediante fosforilazione ossidativa. Il rapporto 32P/14C in Glc-6-P ha quindi fornito una misura dell’attività specifica del substrato ATP utilizzato dall’esochinasi. Il rapporto32P/14C di Glc-6-P prodotto dall’esochinasi legata al mitocondrio è stato confrontato con quello prodotto dall’esochinasi del lievito, che non si lega ai mitocondri e quindi utilizza necessariamente l’ATP extramitocondriale come substrato. La cinetica dell’etichettatura dei pool di ATP usati come substrato dalle esochinasi legate al mitocondrio e dal lievito era sorprendentemente diversa, ancora una volta coerente con l’opinione che l’esochinasi legata al mitocondrio non utilizzava l’ATP extramitocondriale come substrato, ma piuttosto attingeva a un comparto intramitocondriale di ATP fornito dalla fosforilazione ossidativa.Per esempio (Fig. 4), l’aggiunta di un eccesso di 31Pi, diminuendo così marcatamente la specificità del 32P-ATP sintetizzato dalla fosforilazione ossidativa, ha portato a una rapida diminuzione del rapporto 32P/14C di Glc-6-P prodotto dall’esochinasi del lievito, utilizzando ATP extramitocondriale. Al contrario, c’era un ritardo e successivamente una diminuzione un po’ più lenta nel rapporto 32P/14C di Glc-6-P prodotto dall’esochinasi legata al mitocondrio. Queste ultime osservazioni ancora una volta erano coerenti con il punto di vista che l’esochinasi mitocondriale stava utilizzando un dipartimento intramitocondriale di ATP che non era liberamente equilibrato con ATP extramitocondriale.

Un altro approccio sperimentale era basato sul confronto tra l’esochinasi legata al mitocondrio e l’enzima non legato al lievito (de CerqueiraCesar e Wilson, 1998, 2002). La logica sottostante è illustrata nella Fig. 5. Una quantità fissa di mitocondri cerebrali, con esochinasi legata, è mescolata con quantità crescenti di mitocondri di fegato di ratto, che non contengono esochinasi legata. Entrambi i mitocondri del cervello e del fegato sono attivamente fosforilanti e quindi c’è un tasso crescente di produzione di ATP nel sistema come la quantità di mitocondri di fegato è aumentata. Per progettazione, la concentrazione di ATP extramitocondriale è mantenuta sottosatura, cioè ÅKm di esochinasi con ATP extramitocondriale come substrato (in assenza di fosforilazione ossidativa). Se l’esochinasi legata al mitocondrio è usingextramitochondrial ATP come substrato, un aumento progressivo del tasso di Glcphosphorylation è previsto come il tasso di produzione di ATP è aumentato byaddition di quantità crescenti di mitocondri del fegato. Infatti, questo non è ciò che si osserva; piuttosto, il tasso di fosforilazione di Glc da parte dell’esochinasi legata ai mitocondri non è significativamente influenzato dall’aumento del tasso di produzione di ATP (Fig.6). Al contrario, l’aumento previsto del tasso di fosforilazione di Glc è visto se l’esochinasi mitocondriale è sostituita da una quantità equivalente di esochinasi di lievito. Questi risultati sono quindi ancora una volta coerenti con l’opinione che l’esochinasi mitocondriale legata utilizza l’ATP intramitocondriale, intrinseca ai mitocondri con cui l’esochinasi è associata ma indipendente da qualsiasi aumento dell’ATP intramitocondriale proveniente dai mitocondri di fegato privi di esochinasi.

Infine, un’ulteriore prova dell’idea che l’esochinasi legata a livello mitocondriale possa discriminare tra ATP intra ed extramitocondriale viene dall’esame dell’inibizione da parte dell’analogo del Glc-6-P, 1,5-anidroglucitolo-6-P (1,5-AnG6P). In assenza di fosforilazione ossidativa e con l’ATP extramitocondriale come substrato, 1,5-AnG6P è un inibitore piuttosto potente, competitivo rispetto all’ATP (Fig. 7) (Hashimoto e Wilson, 2000). Al contrario, con l’ATP fornito dalla fosforilazione ossidativa, l’1,5-AnG6P è molto meno efficace come inibitore. Chiaramente, l’ATP fornito dalla fosforilazione ossidativa non è equivalente all’ATP intramitocondriale. Risultati simili sono stati recentemente riportati utilizzando l’esochinasi mitocondriale dal cervello bovino (de Cerqueira e Wilson, 2002).

In breve, la visione attuale è che, in assenza di fosforilazione ossidativa, l’esochinasi mitocondriale può usare facilmente l’ATP extramitocondriale, seguendo la cinetica classica di Michaelis-Menten. Durante la fosforilazione ossidativa attiva, tuttavia, l’enzima legato a livello mitocondriale è accoppiato a un pool intramitocondriale di ATP, con il tasso di Glcfosforilazione strettamente correlato al tasso di fosforilazione ossidativa.sembra difficile credere che, nel tessuto normale, i mitocondri siano mai in uno stato totalmente non fosforilante. Cambiamenti nel tasso? Sì, certo, a seconda delle fluttuazioni nella domanda di energia. Ma veramente non fosforilanti? Probabilmente solo nelle circostanze più terribili – e alla fine letali. Ne consegue che, in condizioni normali, il tasso di fosforilazione del Glc è strettamente coordinato con le fasi ossidative terminali del metabolismo del Glc che si verificano nei mitocondri, con la produzione associata di ATP per fosforilazione ossidativa. Come precedentemente notato (BeltrandelRio e Wilson, 1992a), tale coordinamento può garantire l’introduzione di Glc nel metabolismo glicolitico ad un tasso commisurato alle fasi ossidative terminali, evitando la produzione di lattato neurotossico (Marie e Bralet, 1991) mentre assicura il flusso netto attraverso le porzioni citoplasmatiche e mitocondriali della via ad un tasso adeguato per soddisfare le richieste di energia (Fig. 8).

Coordinamento delle fasi glicolitica e ossidativa del metabolismo del glucosio (Glc). Il tasso di fosforilazione del Glc da parte dell’esochinasi legata al mitocondrio, utilizzando l’ATP generato intramitocondrialmente come substrato, è correlato al tasso di fosforilazione ossidativa. Questo meccanismo è suggerito per garantire il coordinamento della fosforilazione Glc, il passo iniziale del metabolismo glicolitico, con le fasi ossidative terminali (ciclo dell’acido tricarbossilico, con trasporto di elettroni associati e fosforilazione ossidativa; frecce in grassetto curvo) che si verificano nei mitocondri, evitando l’accumulo di lattato potenzialmente tossico.

Non si sa come questo notevole cambiamento nella specificità del substrato (ATP intramitocondriale contro extramitocondriale) sia indotto dalla fosforilazione ossidativa, ma è chiaro che la conformazione dell’enzima legato al mitocondrio è influenzata dal potenziale di membrana mitocondriale e da altri fattori relativi alla funzione mitocondriale, indicando un’intima interazione tra le membrane interne (attraverso le quali esiste il potenziale di membrana) ed esterne (alle quali è legata l’esochinasi) di questo organello (Hashimoto e Wilson, 2000).I cambiamenti conformazionali che interessano le regioni della molecola coinvolte nel legame del substrato ATP erano stati precedentemente postulati (de Cerquiera e Wilson, 1998) come responsabili dei cambiamenti nella specificità del substrato.