PCR del gene mecA

Un frammento di 188 bp nel gene mecA e un frammento di 178 bp nel gene Sa442 specifico di S. aureus-specifico Sa442 sono stati amplificati per gli isolati 1 e 2 in reazioni separate su un LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germania) usando SYBR green con i primer Mec-S e Mec-A o Sa442-F e Sa442-RS, rispettivamente, come precedentemente descritto (5). Anche gli isolati Sa442-positivi generano una temperatura di fusione SYBR green di 79°C. S. aureus ATCC 29213 (sensibile all’oxacillina) e S. aureus ATCC 43300 (resistente all’oxacillina) sono stati utilizzati come controlli per il gene Sa442 e come controlli negativi e positivi, rispettivamente, per il gene mecA. In contrasto con i controlli, nessun prodotto mecA o Sa442 è stato generato per gli isolati 1 e 2. Un’ulteriore PCR è stata eseguita per rilevare un frammento più grande di 533 bp del gene mecA (4). Nessun prodotto è stato generato negli isolati 1 e 2 o in S. aureus ATCC 29213, ma un prodotto della dimensione prevista è stato generato da S. aureus ATCC 43300. Il gene 16S rRNA, usato come controllo positivo, è stato amplificato da tutti i ceppi (dati non mostrati).

Il rilevamento accurato e tempestivo della resistenza alla meticillina in S. aureus è una funzione importante del laboratorio di microbiologia clinica (20). Mentre il rilevamento del gene mecA mediante PCR è il gold standard, il test di agglutinazione al lattice PBP2a ha dimostrato di essere un test semplice e rapido, con buone caratteristiche di prestazione per rilevare la resistenza alla meticillina sia in S. aureus che nelle specie stafilococciche coagulasi-negative, nonostante la necessità di induzione preliminare in alcuni casi (1, 21). Il test PBP2a utilizza particelle di lattice sensibilizzate con anticorpi monoclonali sollevati contro PBP2a (11). La specificità di questo test si avvicina al 100% (18, 19). Sebbene non ci siano rapporti riguardanti le prestazioni dei test di agglutinazione al lattice PBP2a per gli isolati di S. intermedius, sono stati notati risultati falsi positivi di PBP2a con due isolati di S. warneri, uno a 1 minuto e l’altro a 6 minuti, che erano entrambi mecA PCR negativi con una MIC di oxacillina di ≤0,5 μg/ml (21). Secondo il foglietto illustrativo del produttore, le reazioni falso-positive sono generalmente agglutinazioni deboli che sono spesso negative su test ripetuti con una cultura fresca. Tuttavia, abbiamo trovato che i nostri due isolati erano ripetutamente positivi dopo subcolture multiple, con uno fortemente positivo. Il ceppo S. intermedius ATCC 29663 era, infatti, negativo al test PBP2a ma era anche fenotipicamente diverso dai due ceppi clinici per quanto riguarda la fermentazione del mannitolo positiva, la negatività alla β-lattamasi e la sensibilità alla penicillina (risultati non mostrati).

La positività alla coagulasi è comunemente usata per attribuire significato clinico e patogenicità agli isolati di Staphylococcus spp. Mentre S. aureus è il più comune stafilococco coagulasi-positivo isolato nel laboratorio clinico, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae, e alcuni ceppi di S. hyicus sono anche coagulasi positivi (1). I laboratori spesso usano una combinazione di test per rilevare la coagulasi libera o il fattore di raggruppamento con e senza la proteina A per identificare gli stafilococchi coagulasi-positivi. Gli isolati di S. intermedius sono positivi per la coagulasi libera ma sono negativi per la proteina A, e il 14% degli isolati ha un fattore di raggruppamento, il che spiegherebbe la coagulasi positiva del vetrino e la debole positività del lattice di Staph BACTi per l’isolato 1 (6). Come descritto in precedenza, abbiamo trovato la positività alla pirrolidonil arilamidasi come un modo rapido per determinare che uno stafilococco coagulasi-positivo non è S. aureus (10). Crediamo che i nostri casi suggeriscano che la vera incidenza di S. intermedius nelle infezioni delle ferite umane sia probabilmente sottostimata, perché tutti gli stafilococchi coagulasi-positivi sono spesso raggruppati come S. aureus (17). In assenza di un’identificazione definitiva di S. intermedius con metodi fenotipici o biochimici, il sequenziamento del gene 16S rRNA si è rivelato utile per la classificazione tassonomica delle specie di Staphylococcus e Macrococcus (8).

Uno studio iniziale del 1989 ha mostrato che il 72% degli isolati di S. intermedius da gengive canine e infezioni di ferite canine erano sensibili alla penicillina, e nessuno era resistente all’oxacillina (16). Uno studio più recente ha rivelato che la resistenza all’oxacillina è un problema crescente negli isolati di S. intermedius, con tassi di resistenza all’oxacillina dal 60 all’85% più elevati per gli isolati da naso, occhi e ascessi di cani rispetto a quelli dagli altri siti (7). Nella prima infezione umana dovuta a S. intermedius resistente alla meticillina, dove era l’agente causale della polmonite, la MIC dell’oxacillina era di 32 μg/ml (3). Entrambi i nostri isolati erano resistenti alla penicillina ed erano β-lattamasi positivi; la MIC dell’oxacillina per questi isolati era di 0,125 μg/ml. La resistenza alla penicillina in questi isolati, in assenza di resistenza all’oxacillina con una PCR mecA negativa e suscettibilità alle combinazioni di inibitori β-lattamici/β-lattamasi, può essere spiegata dal risultato positivo del test della β-lattamasi. Utilizzando il set di primer che punta a un frammento di 533 bp del gene mecA, Gortel et al. hanno confermato che il gene mecA conferisce resistenza alla meticillina negli stafilococchi isolati dai cani (4). Questi ricercatori hanno scoperto che tra 10 ceppi di stafilococchi coagulasi-positivi che portavano il mecA, 9 erano S. aureus e 1 era S. intermedius. Essi hanno ipotizzato che la differenza nella prevalenza della resistenza alla meticillina in S. intermedius rispetto a quella di S. aureus fosse dovuta a una differenza nella regolazione di mecA tra le specie o alla mancanza di un’intensa pressione di selezione antibiotica su S. intermedius (4). Mentre non esistono criteri interpretativi specifici dell’NCCLS per gli stafilococchi coagulasi-positivi diversi dallo S. aureus, i risultati del test di suscettibilità all’oxacillina con metodi fenotipici e genotipici (PCR del gene mecA utilizzando due set di primer che mirano a frammenti di 188- e 533-bp), combinati con basse MIC di oxacillina rispetto a quelle precedentemente riportate per S. intermedius (MIC > 4 μg/ml), stabilisce che gli isolati 1 e 2 in questo studio sono sensibili all’oxacillina (3, 4).

È ben accettato che la resistenza alla meticillina in S. aureus è principalmente dovuta all’acquisizione di una proteina aggiuntiva che lega la penicillina, PBP2a, codificata dal gene mecA. Una ricerca dell’origine del gene mecA ha portato all’identificazione di un possibile precursore evolutivo in S. sciuri, un commensale degli animali. L’omologo mecA in S. sciuri ha mostrato il 79,5% di somiglianza di sequenza del DNA con il gene mecA di S. aureus e l’88% di identità aminoacidica con PBP2a. L’omologo mecA di S. sciuri non conferisce resistenza alla meticillina in natura. Tuttavia, Couto et al hanno identificato isolati di S. sciuri resistenti alla meticillina provenienti dall’uomo, in cui la sovraespressione dell’omologo mecA risultante dall’inserimento di un elemento IS256 a monte del gene strutturale o da alterazioni di un singolo nucleotide nella regione del promotore ha portato alla produzione di una proteina funzionalmente simile alla PBP2a (2). Come gli isolati di S. sciuri, gli isolati di S. intermedius qui descritti possono contenere un omologo mecA che codifica una proteina simile a PBP2a, che reagisce in modo incrociato con il test di agglutinazione al lattice PBP2a ma non conferisce resistenza alla meticillina. Il mimetismo antigenico con una proteina completamente estranea è anche possibile. In entrambi i casi, speriamo di aumentare la consapevolezza nella comunità microbiologica che esistono isolati clinici che possono sfidare la specificità del test di agglutinazione al lattice di PBP2a.

In conclusione, forniamo la prima segnalazione di risultati falsi positivi di PBP2a per due ceppi di S. intermedius che, combinati con un errore iniziale nell’interpretazione dei test fenotipici, hanno portato ad una errata identificazione come MRSA. Risultati falsi positivi di PBP2a potrebbero portare a tentativi di controllo delle infezioni mal indirizzati, all’uso non necessario di antibiotici come la vancomicina e a un aumento generale delle spese ospedaliere (20). Questi casi sottolineano l’importanza di perseguire attivamente i risultati discrepanti dei test di laboratorio per evitare errori di segnalazione. L’identificazione accurata della specie degli stafilococchi coagulasi-positivi è essenziale per determinare la patogenicità, il significato clinico, i modelli di suscettibilità e l’epidemiologia degli isolati clinici.