Abstract

Gli alberi del genere Copaifera sono originari delle regioni tropicali dell’America Latina e dell’Africa occidentale. La Copaifera sp è ampiamente utilizzata come medicina popolare e ha varie indicazioni etnofarmacologiche, tra cui la gonorrea, la bronchite, l’asma, le ulcere della pelle, le ulcere, il mal di gola, le infezioni uterine, le infiammazioni generali, il cancro e leishmaniosi. L’acido kaurenoico è un diterpene naturale che si trova nella Copaifera ed è stato usato come antinfiammatorio, trattamento dell’ulcera, leishmaniosi e cancro. Tenendo presente il fatto che il test di Ames è uno strumento eccellente per valutare la sicurezza degli estratti, degli oli e delle sostanze fitochimiche isolate dalle piante medicinali, da esso valutiamo il potenziale mutageno di quattro specie, tra oleoresine (C. oblongifolia; C. langsdorffii) ed estratti di foglie (C. lucens; C. multijuga), del genere Copaifera e anche dell’acido kaurenoico, che è uno dei suoi composti principali. I risultati hanno mostrato che la Copaifera spp. e l’acido kaurenoico non hanno indotto un aumento del numero di colonie revertanti, senza effetto mutageno negli esperimenti, in tutte le concentrazioni valutate dal test di Ames. I risultati ottenuti nel nostro studio supportano l’uso sicuro delle piante medicinali del genere Copaifera selezionate e dell’acido kaurenoico.

1. Introduzione

Nella storia, diverse culture hanno usato le piante per scopi medicinali. Infatti, le piante hanno dimostrato di essere una fonte di medicinali per il trattamento di un ampio spettro di malattie. Oggi, i sistemi basati sulle piante continuano a svolgere un ruolo essenziale per la salute e l’interesse per i prodotti fitomedicinali è aumentato in tutto il mondo, tanto che le piante sono ancora oggetto di studi come fonte di nuovi agenti medicinali.

Gli alberi appartenenti al genere Copaifera sono originari delle regioni tropicali dell’America Latina e dell’Africa occidentale. Il genere Copaifera appartiene alla famiglia delle Leguminose e comprende 72 specie. Più di 20 Copaifera spp. esistono nel territorio brasiliano, dove sono chiamate “copaibeiras”, “pau d’óleo”, o “copaíbas”. Le Copaifera spp. sono ampiamente utilizzate nella medicina popolare. Hanno varie indicazioni etnofarmacologiche, come il trattamento di gonorrea, bronchite, asma, ulcere della pelle, ulcere, mal di gola, infezioni uterine, infiammazioni generali, cancro e leishmaniosi.

La letteratura scientifica contiene numerosi rapporti sulle attività farmacologiche delle specie di Copaifera, come le loro azioni antinfiammatorie, antitumorali, antiproliferative, antielmintiche, antitubercolari, gastroprotettive, chemiopreventive, immunomodulanti e antibatteriche, tra le altre.

L’acido caurenoico è un diterpene che si trova naturalmente in alcune piante brasiliane, tra cui le oleoresine di Copaifera. Innumerevoli proprietà farmacologiche sono state riportate per l’acido kaurenoico, come il suo effetto antinfiammatorio, il suo uso per trattare l’ulcera, e il suo potenziale antiparassitario, analgesico e antitumorale.

Perché i composti naturali sono stati tradizionalmente utilizzati, sono spesso considerati sicuri. Tuttavia, molti studi hanno riportato che diverse specie di piante applicate nella medicina tradizionale mostrano effetti mutageni, cancerogeni o tossici. Ciononostante, un certo numero di piante e prodotti fitoterapici continuano ad essere applicati senza prove scientifiche della loro sicurezza.

Il test di Ames è globalmente noto per la sua capacità di individuare mutazioni puntiformi causate da diversi agenti. Questo test impiega ceppi indicativi di Salmonella Typhimurium che sono sensibili a sostanze che inducono diversi tipi di mutazioni. Sulla base del test di Ames, è possibile stabilire l’azione mutagena di un composto in funzione della concentrazione di S. Typhimurium. Questo test viene applicato per lo screening iniziale del potenziale mutageno di nuovi farmaci in tutto il mondo. Una risposta mutagena ha un alto valore predittivo di cancerogenicità. Nel corso degli anni, la comunità scientifica, le agenzie governative e le aziende hanno riconosciuto il valore di questo test.

Tenendo presente che il test di Ames è uno strumento eccellente per valutare la sicurezza degli estratti, degli oli e delle sostanze fitochimiche isolate dalle piante medicinali, abbiamo utilizzato questo test per valutare il potenziale mutageno delle oleoresine o degli estratti di foglie di quattro specie di Copaifera e dell’acido kaurenoico.

2. Materiali e metodi

2.1. Materiale vegetale

Il materiale vegetale è stato raccolto in diversi stati brasiliani tra agosto 2012 e maggio 2014. I buoni delle piante sono stati identificati dalla dott.ssa Regina Celia Vianna Martins da Silva del laboratorio botanico della Corporazione Brasiliana di Ricerca Agricola (Embrapa), Belém, Stato di Pará, Brasile, o dal dott. Milton Groppo Junior del Dipartimento di Biologia dell’Università di San Paolo, Campus Ribeirão Preto, Stato di San Paolo, Brasile, dove i buoni sono stati depositati. La tabella 1 elenca le informazioni sugli esemplari buoni.

Per prelevare le oleoresine di C. oblongifolia e C. langsdorffii, è stata usata una trivella per fare un foro del diametro di circa un pollice. Il foro è stato praticato al centro del tronco dell’albero, a un metro da terra. L’oleoresina è stata scaricata in una bottiglia d’ambra per mezzo di un tubo collegato ad un filtro. Dopo aver raccolto l’oleoresina, il foro è stato adeguatamente sigillato.

Le foglie di C. lucens e C. multijuga sono state essiccate all’aria a 40°C per 48 ore o liofilizzate e polverizzate in un frullatore. La polvere ottenuta è stata sottoposta a macerazione in etanolo/acqua 7:3 a temperatura ambiente per 48 ore. Dopo la filtrazione, il solvente è stato evaporato sotto 40°C sotto vuoto. Questa procedura è stata ripetuta quattro volte, e gli estratti sono stati combinati, concentrati sotto vuoto, e liofilizzati, il che ha fornito una media del 20% p/p di estratti idroalcolici grezzi di foglie.

L’acido saurenoico (Figura 1), purezza superiore al 99%, è stato isolato come dettagliato da Simão et al. Le oleoresine e le foglie della specie Copaifera sono state raccolte e la ricerca è stata sviluppata dopo l’autorizzazione del governo brasiliano attraverso il SISBIO (Biodiversity Information and Authorization System #35143-1) e il CGEN (Genetic Heritage Management Council #010225/2014-5).

Figura 1

Struttura chimica dell’acido kaurenoico.

2.2. Test di Ames

Il test di Ames è stato usato per studiare la mutagenicità della Copaifera spp. La metodologia di preincubazione sviluppata da Maron e Ames, con e senza attivazione esogena (S9), è stata impiegata per analizzare diversi ceppi di Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA97a e TA102) nel tentativo di identificare gli agenti che causano mutazioni genetiche. I ceppi tester, gentilmente forniti dal Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA), sono stati coltivati da colture congelate per 12-14 ore, durante la notte, in Oxoid Nutrient Broth Number 2.

Per il saggio di attività mutagena, varie concentrazioni di ciascuna oleoresina, ciascun estratto o acido kaurenoico sciolto in DMSO sono stati aggiunti a 0,1 mL di coltura batterica in 0,5 mL di tampone fosfato 0,2 M o 0,5 mL di miscela S9 al 4% e incubati a 37°C per 20-30 min. Le concentrazioni variavano da 62,5 a 500 μg/piastra per il C. lucens (estratto), da 120 a 1000 μg/piastra per il C. multijuga (estratto), da 125 a 1000 μg/piastra per il C. oblongifolia (oleoresina), da 500 a 4000 μg/piastra per il C. langsdorffii (oleoresina), e da 25 a 200 μg/piastra per l’acido kaurenoico. Queste concentrazioni sono state selezionate sulla base di un test preliminare di tossicità. In tutti i saggi successivi, il limite superiore della gamma di dosi testate era la dose non tossica più alta o la dose tossica più bassa determinata nel saggio preliminare. La tossicità è stata rilevata come una riduzione del numero di istidine revertants (His+) o come un assottigliamento del prato di fondo auxotrofico.

La miscela di attivazione metabolica (frazione S9) preparata dal fegato di ratti Sprague Dawley trattati con la miscela di bifenili policlorurati Aroclor 1254 (500 mg/kg) è stata acquistata da Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) e preparato fresco prima di ogni test. Il sistema di attivazione metabolica consisteva nel 4% di frazione S9, 1% di cloruro di magnesio 0,4 M, 1% di cloruro di potassio 1,65 M, 0,5% di D-glucosio-6-fosfato disodico 1 M, e 4% di nicotinamide adenina dinucleotide fosfato sale sodico (NADP) 0.1 M nel 50% di tampone fosfato 0,2 M e 39,5% di acqua distillata sterile.

Dopo l’incubazione, sono stati aggiunti 2 mL di top agar, e la miscela è stata versata su una piastra contenente agar minimo. Le piastre sono state incubate a 37°C per 48 ore e le colonie His+ revertant sono state contate manualmente.

I risultati sono stati analizzati con il pacchetto software statistico Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, dal Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); è stato adottato il modello di Bernstein et al. I dati (revertants/piastra) sono stati valutati mediante analisi della varianza (ANOVA), seguita da regressione lineare. Anche l’indice mutageno (MI) è stato calcolato per ogni concentrazione testata e corrispondeva al numero medio di revertants per piastra di test diviso per il numero medio di revertants per piastra di controllo con solvente. Un campione è stato considerato mutageno quando è stata rilevata una relazione dose-risposta e l’MI era superiore a due (MI > 2) a una o più concentrazioni.

I seguenti mutageni standard sono stati utilizzati come controlli positivi negli esperimenti senza miscela S9: 4-nitro-O-fenilendiammina (10 μg/piastra) per TA98 e TA97a, sodio azide (1,25 μg/piastra) per TA100, e mitomicina C (0,5 μg/piastra) per TA102. Negli esperimenti con l’attivazione S9, la 2-antramina (1,25 μg/piastra) è stata usata come controllo positivo per TA98, TA97a e TA100, e la 2-aminofluorene (10 μg/piastra) è stata impiegata come controllo positivo per TA102. Il DMSO è servito come solvente di controllo (100 μL/piastra) e il controllo negativo corrisponde al tasso di reversione spontanea di ogni ceppo.

3. Risultati

La tabella 2 mostra il numero medio di revertants/piastra (M), la deviazione standard (SD) e l’indice mutageno (MI) osservati per S. Typhimurium TA98, TA100, TA102 e TA97a in presenza (+S9) o in assenza (-S9) di attivazione metabolica dopo il trattamento del campione con l’oleoresina, l’estratto o il composto target.

Né gli estratti di foglie di C. lucens e C. multijuga né le oleoresine di C. langsdorffii e C. oblongifolia hanno causato mutazioni genetiche, come evidenziato dal test di Ames. L’acido kaurenoico non ha aumentato il numero di colonie revertanti, quindi non ha esercitato effetti mutageni a nessuna delle concentrazioni testate o su nessuno dei ceppi valutati. Il controllo con solvente (DMSO) non differiva significativamente del numero di revertanti dal controllo negativo.

4. Discussione

Gli effetti mutageni esercitati dalle piante non sono facilmente percepibili nell’uomo, e possono manifestarsi esiti avversi a lungo termine come il cancro. Pertanto, la letteratura scientifica ha evidenziato l’importanza dello screening delle piante medicinali per la loro potenza mutagena. In questo senso, qui abbiamo esaminato il potenziale mutageno della Copaifera spp. e dell’acido kaurenoico con l’aiuto del test di Ames. Akyıl e Konuk hanno sottolineato che il rilevamento di agenti genotossici si basa spesso sull’uso di batteri come organismi di prova. In questo modo, il test di Ames (o test Salmonella/microsoma) è il metodo più comunemente usato per rilevare gli effetti mutageni degli agenti genotossici.

La performance del test di Ames utilizzando diversi ceppi è di grande importanza considerando le peculiarità di ciascuno di essi in relazione al test. Così, il marcatore hisG46 nel ceppo TA100 risulta dalla sostituzione di una leucina (GAG/CTC) con una prolina (GGG/CCC). Questa mutazione viene riportata allo stato wild-type da mutageni che causano mutazioni di sostituzione di coppie di basi principalmente in una delle coppie GC. La mutazione hisD3052 portata dal ceppo TA98 è una mutazione frameshift -1 che colpisce il frame di lettura di una vicina sequenza ripetitiva -C-G-C-G-C-G-C-G-. La reversione della mutazione hisD3052 allo stato wild-type è indotta da vari mutageni frameshift come il 2-nitrofluorene e vari derivati nitroso aromatici delle ammine cancerogene. La mutazione hisD6610 nel ceppo TA97a porta anche una mutazione frameshift +1 (citosina) risultante in una serie di 6 citosine (-C-C-C-C-C-C-). Si ritiene che questo ceppo sia più sensibile ad alcuni dei mutageni che invertono il ceppo TA98. È stato sviluppato il ceppo TA102 che contiene AT coppie di basi nel sito mutante hisG428. La mutazione è portata sul plasmide multicopia pAQ1. Il plasmide conferisce resistenza alla tetraciclina, che è un marcatore conveniente per rilevare la presenza del plasmide. La mutazione hisG428 è una mutazione ocra, TAA, nel gene hisG che può essere invertita da tutti i sei possibili cambiamenti di coppie di basi; sia transizioni che trasversioni. Questa mutazione è anche invertita da mutageni che causano danni ossidativi, oltre a rilevare agenti reticolanti.

Inoltre, una sostanza chimica biologicamente attiva può essere biotrasformata in un metabolita inattivo. Allo stesso modo, una sostanza chimica inattiva può essere biotrasformata in un metabolita attivo. Quindi, è importante utilizzare la frazione S9 nel test di Ames: permette di effettuare analisi in presenza di metabolismo, fornendo così risultati più affidabili.

Per quanto riguarda la sicurezza, nei nostri risultati, né l’acido kaurenoico né le piante studiate (estratti e oleoresine) hanno esercitato effetti mutageni nei diversi ceppi di Salmonella Typhimurium, indipendentemente dall’attivazione di S9.

La maggior parte degli articoli sul genere Copaifera riguardano le oleoresine rimosse dal tronco dell’albero. Tuttavia, lo studio degli estratti di foglie è anche rilevante perché contengono molecole bioattive promettenti. Infatti, la ricerca della cura delle malattie attraverso l’infusione delle foglie potrebbe essere stato uno dei primi modi di utilizzare i prodotti naturali, una pratica che è ancora adottata al giorno d’oggi.

Molte Copaifera spp. sono impiegate popolarmente come piante medicinali in diversi paesi perché queste specie presentano numerose proprietà farmacologiche. Come per l’acido kaurenoico, sono stati riportati anche diversi effetti biologici.

Il nostro studio è il primo a indagare sulla sicurezza delle specie C. lucens e C. oblongifolia e anche a utilizzare C. langsdorffii in oleoresina per lo studio della mutagenicità. Gli effetti di C. multijuga (oleoresina/estratto) sul DNA sono stati affrontati in studi precedenti, tuttavia, utilizzando tecniche diverse rispetto al nostro studio che ha utilizzato il test di Ames. Così, i nostri risultati confermano i dati pubblicati da altri autori, che hanno testato altre specie di Copaifera e i loro costituenti chimici, o utilizzato diversi modelli sperimentali, e hanno dimostrato che non danneggiano il DNA.

In questo modo, l’oleoresina di C. multijuga e il suo marker chimico, l’acido copalico diterpene, sono stati valutati da Alves et al. attraverso il test del micronucleo (cellula V79) e il test di Ames per lo studio in vitro, così come i test del micronucleo e della cometa (topi svizzeri) per il test in vivo. I dati ottenuti hanno mostrato che nessuno di loro esercita alcun effetto genotossico/mutageno nelle condizioni sperimentali impiegate. Se confrontati con i nostri risultati, questi dati indicano che per C. multijuga sia l’estratto, che è stato valutato nel nostro studio, sia l’oleoresina, come valutato da Alves et al. , non influenzano il numero di colonie revertanti rispetto al controllo negativo nel test Ames; lo stesso vale per l’acido copalico e l’acido kaurenoico. Questi risultati suggeriscono che la mutagenicità è assente, indipendentemente dall’attivazione metabolica.

In un recente studio Furtado et al. hanno valutato il potenziale genotossico di C. multijuga e i risultati hanno dimostrato l’assenza di danni al DNA, visto che il trattamento sia con l’oleoresina che con l’estratto di foglie di C. multijuga non ha aumentato significativamente la frequenza dei micronuclei in vitro (cella V79) e in vivo (topi svizzeri). Inoltre, gli autori hanno anche valutato estratti e oleoresine di altre specie di questo genere, come C. duckei, C. reticulata, C. paupera e C. pubiflora e così come i risultati trovati per C. multijuga, l’assenza di genotossicità è stata riportata per tutte le specie testate.

I risultati ottenuti negli studi di Alves et al. e Batista et al. hanno dimostrato che l’estratto di C. langsdorffii non ha aumentato significativamente la frequenza di micronuclei (topi svizzeri) nel sangue periferico e nel midollo osseo, rispettivamente. In un altro studio, il test della cometa utilizzando ratti Wistar non ha rivelato alcuna differenza significativa tra gli animali trattati con il solo estratto di C. langsdorffii e il gruppo di controllo negativo. Questi dati dimostrano che l’estratto non mostra genotossicità.

Di recente, il test del micronucleo in vivo e il test della cometa su ratti Wistar hanno dimostrato che l’estratto di Copaifera malmei non è genotossico e ha un’attività antimutagena. Inoltre, il test di tossicità subcronica non ha rivelato cambiamenti tossicologicamente rilevanti, come giudicato dalle analisi comportamentali, biochimiche ed ematologiche fino a 30 giorni. Questi risultati hanno indicato che l’estratto di Copaifera malmei ha un alto margine di sicurezza per l’uso terapeutico. Le determinazioni della tossicità e della genotossicità hanno evidenziato che l’uso dell’olio di Copaiba è anche sicuro: la valutazione istopatologica non ha rivelato cambiamenti negli animali trattati con olio di Copaiba, e la valutazione della mutagenicità (test del micronucleo; 2000 mg/kg b.w.) non ha mostrato effetti genotossici.

Leandro et al. hanno usato il test Ames per dimostrare che l’estratto di C. trapezifolia non è mutageno contro gli stessi ceppi di Salmonella Typhimurium testati qui, indipendentemente dall’attivazione metabolica.

In relazione alla composizione chimica delle varie specie di Copaifera, le analisi UPLC-MS/MS e CG/MS delle oleoresine hanno identificato diterpeni acidi e sesquiterpeni volatili principali, mentre nelle foglie è stato verificato un alto contenuto di composti fenolici tra cui eterosidi flavonoidi e derivati dell’acido galloilchinico. Tra i costituenti dell’oleoresina, i diterpeni sono di gran lunga i componenti principali e comprendono l’acido ent-agatico, l’acido ent-copalico e l’acido ent-kaurenoico, seguiti da sesquiterpeni come il β-bisabolene, l’α-humulene e il trans-β-cariofillene. Nel caso degli estratti idroalcolici delle foglie della specie Copaifera, essi contengono principalmente quercetina, afzelina e acidi chinici.

Secondo Almeida et al. l’oleoresina di Copaiba (prodotto commerciale) e le sue frazioni, che contengono sesquiterpeni, esteri metilici dell’acido carbossilico diterpenico e alti livelli di β-cariofillene, non sono genotossici come evidenziato dal test della cometa in vivo o dal test del micronucleo. Il β-cariofillene, il principale costituente delle oleoresine e delle frazioni volatili, non promuove effetti citotossici o genotossici nelle colture di linfociti umani, e protegge dai danni al DNA indotti dal solfonato di etile metano. La valutazione di nove sesquiterpeni, compreso il trans-cariofillene, mediante il test di Ames ha dimostrato che nessuno dei composti è mutageno.

In uno studio recente, il trattamento di linee cellulari di cancro gastrico e di mucosa gastrica normale con acido kaurenoico ha mostrato che la concentrazione di acido è fortemente correlata con l’indice di danno al DNA e con la frequenza dei micronuclei, come determinato dal test della cometa e dal test dei micronuclei, rispettivamente. D’altra parte, Cavalcanti et al. hanno riferito che basse concentrazioni di acido kaurenoico, un diterpenoide bioattivo estratto da C. langsdorffii, non esercitano danni al DNA né alterano la frequenza dei micronuclei nelle cellule V79. Un danno al DNA significativamente aumentato è diventato evidente solo dopo l’esposizione delle cellule a concentrazioni più elevate di acido kaurenoico (30 o 60 μg/mL).

Qui abbiamo determinato la tossicità dell’acido kaurenoico per ogni ceppo di Salmonella Typhimurium valutato utilizzando concentrazioni di acido a partire dal limite di tossicità. Concentrazioni più elevate di acido kaurenoico impediscono la crescita batterica, il che ci ha permesso di valutare il potenziale mutageno di questo composto. Sulla base dei nostri risultati, le oleoresine testate qui non sono mutagene anche alle più alte concentrazioni testate.

Secondo la letteratura, l’uso di diversi organismi o diversi sistemi di test può fornire risultati diversi. Questo perché i sistemi di test di genotossicità e mutagenicità sono divisi in due gruppi. I metodi citogenetici analizzano gli eucarioti e danno informazioni che variano dalla mutazione genica al danno cromosomico e alle aneuploidie. Al contrario, i metodi batterici analizzano i procarioti e forniscono informazioni sulla mutazione genica e sul danno primario al DNA causato da un agente.

Quindi, test come lo scambio cromatidico tra sorelle, l’aberrazione cromosomica e il micronucleo sono stati applicati per rilevare il danno al DNA a livello cromosomico nel biomonitoraggio umano, mentre il test di mutagenicità Ames Salmonella/microsoma è stato ampiamente impiegato per verificare l’attività mutagena di innumerevoli sostanze chimiche ed estratti vegetali grezzi.

Secondo Ferguson, le sostanze possono essere clastogeniche nel caso delle cellule di mammifero, come nel caso delle sostanze utilizzate nel test del micronucleo. Tuttavia, queste stesse sostanze possono risultare negative nei test batterici come il test di Ames. Quindi, è importante valutare la sicurezza delle piante o dei loro composti chimici concentrandosi sulla valutazione dei diversi tipi di danno genetico. L’associazione del test di Ames con studi in vitro su cellule di mammifero è raccomandata perché possono coprire diversi parametri mutageni essenziali (mutazioni genetiche, danni cromosomici strutturali e aneuploidia) e coprire anche i test in sistemi procarioti ed eucarioti. Inoltre, la letteratura evidenzia anche che lo studio con il test di Ames non dovrebbe essere omesso perché il test di mutazione genica batterica rileva tutte le modalità di azione rilevanti che portano specificamente a mutazioni geniche .

I lavori precedenti hanno osservato che i composti possono essere esclusivamente positivi in una o più linee cellulari di mammiferi, cioè, i risultati positivi non sono stati sostenuti dal test di Ames o dai test in vivo . Infatti, i risultati ottenuti prima con il test di Ames sono successivamente riprodotti nei test con gli animali; quindi, l’assenza di mutagenicità nel test di Ames ha permesso di produrre nuovi farmaci con meno effetti collaterali. Questi dati evidenziano l’importanza di studi come il nostro, che dimostrano l’assenza di mutagenicità delle piante e dei loro principali componenti, utilizzando il test di Ames.

5. Conclusioni

In generale, i nostri risultati supportano l’uso sicuro delle piante medicinali selezionate appartenenti al genere Copaifera. Tuttavia, gli effetti mutageni dei singoli composti potrebbero essere mascherati a causa degli effetti antagonisti di altri composti presenti negli estratti o nelle oleoresine. Quindi, i nostri risultati dimostrano anche che sia l’acido kaurenoico che le piante medicinali valutate possono essere considerate potenzialmente sicure per l’uso terapeutico.

Data Availability

I dati utilizzati per sostenere i risultati di questo studio sono inclusi nell’articolo.

Disclosure

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende, e Jaqueline Lopes Damasceno hanno avuto pieno accesso a tutti i dati dello studio e si assumono la responsabilità per l’integrità dei dati e la precisione dell’analisi dei dati.

Conflitti di interesse

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Contributi degli autori

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani, e Jairo Kenupp Bastos hanno dato contributi sostanziali alla concezione e progettazione, acquisizione, analisi e interpretazione dei dati. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende, e Carlos Henrique Gomes Martins sono stati coinvolti nella stesura del manoscritto o nella sua revisione critica per importanti contenuti intellettuali. Carlos Henrique Gomes Martins e Flávia Aparecida Resende hanno accettato di essere responsabili di tutti gli aspetti del lavoro. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano CAPES (Coordinamento per il miglioramento del personale dell’istruzione superiore), CNPq (Consiglio nazionale per lo sviluppo scientifico e tecnologico), e la Fondazione per la ricerca di San Paolo (FAPESP, sovvenzioni n. 2011/13630-7 e 2012/25237-0) per il sostegno finanziario e l’Università di Franca per il sostegno ricevuto. Jaqueline Lopes Damasceno è stata la destinataria di una borsa di dottorato CAPES (Coordinamento per il Miglioramento del Livello Superiore di Educazione-Personale).