Gene targeting in cellule staminali embrionali

Attraverso il processo di gene targeting in cellule ES, potenzialmente qualsiasi manipolazione genetica desiderata può essere introdotta nella linea germinale dei topi. Sequenze geniche specifiche possono essere eliminate costitutivamente o condizionatamente (Knock-out), mutazioni specifiche o alterazioni di coppie di basi possono essere fatte con precisione all’interno di un gene di interesse e geni reporter o altre cassette di espressione possono essere introdotte in posizioni definite all’interno del genoma (Knock-in). Le sequenze murine possono essere scambiate con sequenze umane usando questa tecnologia per generare modelli murini umanizzati.

Questa tecnica può richiedere fino a un anno di tempo di sviluppo, quindi è essenziale investire molto tempo all’inizio del progetto per assicurare che la tecnologia e la strategia genetica più appropriate siano selezionate per il modello richiesto. Il nucleo transgenico può fornire consulenza per questi tipi di decisioni ed è essenziale che tutti i progetti di targeting siano discussi in dettaglio con il nucleo prima di iniziare il lavoro in laboratorio.

Quando una strategia è stata decisa, viene costruito un vettore di targeting e viene ideata e testata una robusta strategia di screening per garantire che la manipolazione genomica richiesta possa essere rilevata a livello genomico. Il vettore di targeting viene quindi trasfettato in cellule ES e i cloni ricombinanti vengono controllati per l’evento di ricombinazione omologa desiderato. Queste cellule vengono poi iniettate in embrioni pre-impianto e i topi chimerici risultanti vengono utilizzati per la riproduzione della linea di topo geneticamente modificata.

Servizio

Si offre un servizio flessibile che può essere suddiviso nelle fasi specifiche di sviluppo del modello, a seconda delle risorse disponibili.

Inizio del progetto – gratuito

• Consulenza con il gruppo per indirizzare una tecnologia appropriata per ottenere un modello sicuro e utilizzabile
• Screening delle banche dati delle trappole geniche per cloni preesistenti di cellule ES
• Screening delle risorse del consorzio Knock-out per vettori di targeting preesistenti, cloni e modelli di cellule ES

Consulenza per la costruzione di vettori di targeting – gratuita

• Analisi della sequenza genomica per identificare le regioni che hanno un’alta probabilità di essere regioni omologiche utilizzabili per il targeting genico
• Consulenza con il gruppo per affrontare la strategia genetica necessaria per ottenere un modello sicuro, modello sicuro e utilizzabile
• La costruzione del vettore di targeting non è fornita dal nucleo, ma il nucleo può assistere con la fornitura di cassette e consigli metodologici
• La definizione della strategia di screening non è fornita dal nucleo, ma il nucleo può assistere con la fornitura di cassette e consigli metodologici consulenza

Gene Targeting in cellule staminali embrionali

• Trasfezione del vettore di targeting completato in cellule staminali embrionali
• Isoluzione e conservazione di almeno 192 cloni cellulari ricombinanti indipendenti
• Preparazione del DNA e consegna di piastre a 96 pozzetti per lo screening
• Scongelamento, espansione dei cloni positivi putativi
• Preparazione del DNA supplementare dai cloni positivi putativi per lo screening di conferma
• Analisi del cariotipo dei cloni mirati

Iniezione di blastocisti di cloni di cellule ES

• Iniezione di cellule ES in embrioni preimpianto
• Generazione e alloggiamento di chimere per un massimo di 3 settimane.
• Raccomandazioni per la strategia di allevamento