Materiali e metodi

Raccolta dei campioni

I partecipanti di età superiore ai 18 anni sono stati invitati a partecipare allo studio tramite notifiche via e-mail e annunci inseriti nelle bacheche della University of British Columbia, Vancouver BC. Ai partecipanti è stato chiesto di fornire campioni utilizzando tamponi buccali a secco (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) e tamponi buccali con punta a spugna (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) utilizzando istruzioni autoguidate; l’ordine in cui questi campioni sono stati dati è stato randomizzato al computer. Un assistente di ricerca era presente durante la raccolta dei campioni per rispondere alle domande dei partecipanti sulle istruzioni per la raccolta dei campioni. Tutti i campioni sono stati conservati a temperatura ambiente. I rapporti farmacogenetici non sono stati dati ai partecipanti, in quanto ciò non rientrava nell’ambito di questo studio.

Estrazione del DNA

Il DNA è stato estratto utilizzando il kit di estrazione del DNA basato sulle sfere Ambion MagMAX (Applied Biosystems, Foster City, CA) secondo le istruzioni del produttore. Il DNA è stato estratto 3 giorni dopo la raccolta del campione ed eluito in 60 µl. La quantità e la qualità del DNA sono state valutate utilizzando il test di fluorescenza Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). La purezza dei campioni è stata determinata dai valori di densità ottica A260/280 (ODA260/280) utilizzando lo spettrofotometro NanoVue.

Genotipizzazione

La genotipizzazione è stata eseguita sullo strumento QuantStudio 12K Flex per la reazione quantitativa a catena della polimerasi (qPCR) (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) su test convalidati dal produttore (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Il contenuto dei saggi comprendeva 28 SNPs che influenzano la risposta al farmaco sulla piattaforma OpenArray (vedi file aggiuntivo 2) e un saggio CYP2D6 CNV TaqMan (ID saggio: Hs_00010001_cn). Per convalidare i saggi, sono stati genotipizzati 44 controlli del DNA dall’Istituto nazionale delle scienze mediche generali (NIGMS), Human Genetic Cell Repository presso l’Istituto Coriell per la ricerca medica. La concordanza delle chiamate è stata confermata con il genotipo previsto. Inoltre il sequenziamento Sanger del DNA di controllo ha verificato i risultati. Per ogni esecuzione, i campioni dei partecipanti sono stati eseguiti in duplicato sull’OpenArray e in quadruplicato sul test CNV insieme a campioni di DNA Corriell utilizzati come controlli positivi e controlli senza template (NTC).

Analisi statistica

Il software TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) è stato utilizzato per determinare i tassi di chiamata dei genotipi SNP sull’OpenArray. Il tasso di chiamata del genotipo è stato calcolato per ogni test OpenArray, dividendo il numero totale di genotipi assegnati con successo per il numero totale di tentativi di assegnazione del genotipo.

Per il test CNV TaqMan è stato utilizzato il software CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) per assegnare le chiamate del numero di copie CYP2D6 e i punteggi di fiducia CNV. Ai campioni di DNA è stato assegnato un numero di copie diploidi di tipo selvaggio e le variazioni del numero di copie (eventi di delezione o duplicazione) sono state raggruppate nei gruppi 2N e CNV, rispettivamente. Un tasso di chiamata di genotipizzazione del 95% e un punteggio di confidenza del 95% sono stati fissati per i risultati di genotipizzazione SNP e CNV, rispettivamente. Un test t di Student a due campioni, assumendo varianze ineguali, è stato calcolato per determinare la differenza significativa tra la resa del DNA, la purezza e i tassi di chiamata dai diversi tipi di DNA in coppia. Le assegnazioni di genotipizzazione generate dal tipo di campione di DNA (con punta di spugna o con blocco a secco) dallo stesso partecipante sono state confrontate per calcolare la concordanza.

Risultati

Trentuno partecipanti sono stati reclutati e hanno raccolto tamponi con punta di spugna e tamponi con blocco a secco. I partecipanti hanno trovato le istruzioni auto-guidate per la raccolta semplici e facili da seguire per entrambi i tipi di tampone. I partecipanti hanno sollevato domande sulla pressione necessaria per strofinare i tamponi e sul corretto posizionamento dei tamponi in bocca. I commenti dei partecipanti sui due tamponi erano simili, con alcuni che preferivano i tamponi con la punta di spugna e altri che preferivano i tamponi a secco; non c’era un consenso di opinioni.

C’era una differenza significativa nella resa media di DNA raccolto utilizzando tamponi a secco rispetto ai tamponi con la punta di spugna (0,26 ± 0,34 µg contro 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; Tabella 1). La purezza media del DNA in tutti i tipi di raccolta era nell’intervallo accettato per il DNA puro (media (SD)) 1,72(0,78) e 1,85(0,39) per i tamponi secchi e i tamponi con punta di spugna, rispettivamente.

C’erano tre campioni raccolti da tamponi con punta di spugna che avevano basse concentrazioni di DNA (< 5 ng/µl). Questi tre campioni avevano tassi di chiamata di genotipizzazione del 100% su OpenArray e punteggi di confidenza CNV del 100% (Fig. 1). Al contrario, uno dei campioni che aveva una concentrazione di DNA di 79 ng/µl aveva il tasso di chiamata OpenArray più basso (18%). I tassi di chiamata più alti sull’OpenArray (> 95%) per i tamponi a secco sono stati osservati per sette campioni con una concentrazione compresa tra 1,2 e 8,9 ng/µl (Fig. 1a). Le chiamate di fiducia CNV più alte (> 95%) sono state osservate per i campioni con concentrazione compresa tra 1,0 e 24,4 ng/µl (Fig. 1b).

Per tutti i saggi su OpenArray, I campioni di DNA raccolti da tamponi con punta a spugna hanno portato a tassi di chiamata di genotipizzazione complessivamente più elevati (97%) rispetto ai tamponi a secco (54%) (Fig. 2). Con un passaggio aggiunto di una diluizione 0,5 × del DNA estratto, i tamponi con spugna avevano un tasso di chiamata di genotipizzazione coerente > 95%. Il tasso di chiamata del campione sull’OpenArray variava in base all’individuo con 29 (93,5%) partecipanti che avevano tassi di chiamata del campione > 95% dal DNA del tampone con spugna e 4 (12,9%) che avevano tassi di chiamata del campione > 95% dal DNA del tampone con blocco a secco. Una concordanza del 94% di saggi genotipizzati con successo è stata osservata tra i tamponi a spugna e quelli a secco raccolti dallo stesso individuo.

Le chiamate di numeri di copia per CYP2D6 sono state assegnate a 2 (6,5%) dei campioni provenienti da tamponi con punta di spugna con un punteggio complessivo di confidenza di 0,99. In confronto, a 8 (25,8%) dei campioni provenienti da tamponi a secco sono stati assegnati numeri di copia con un punteggio complessivo di confidenza di 0,91 (vedi file aggiuntivo 3).

Discussione

Lo scopo di questa ricerca è di aiutare gli investigatori e le aziende a identificare un metodo di raccolta ottimale che produca DNA di alta qualità per la genotipizzazione. Questo studio fornisce nuove informazioni sulla qualità del DNA per due tipi di tamponi, che era alta (definita come ODA260/A280 1.8) anche se c’era una differenza significativa nella resa del DNA (p-value = 4.4-7). Sulla piattaforma OpenArray, i tamponi con spugna avevano il più alto tasso complessivo di chiamate di genotipizzazione (97% contro 54%) e il più alto punteggio di confidenza per il saggio CYP2D6 CNV TaqMan (0,99 contro 0,91). Un tasso di chiamata di genotipizzazione SNP del > 95% è considerato riflettere dati di qualità accettabile e un punteggio di fiducia CNV del 99% è considerato di alta qualità.

Un campione di DNA isolato dal tampone con punta di spugna aveva un tasso di chiamata inferiore al 95%. Nella pratica di laboratorio di routine, i campioni con bassi tassi di chiamata verrebbero ritirati a causa di risultati incompleti per i rapporti dei pazienti. Omettendo questo campione, il tasso complessivo di genotipizzazione è aumentato al 99,5% per i tamponi con la spugna.

I risultati CNV di CYP2D6 hanno mostrato un aumento delle assegnazioni CNV per il DNA raccolto dai tamponi a secco 8 (25,8%) rispetto ai tamponi con la spugna 2 (6,5%). Un numero maggiore di assegnazioni CNV era correlato a punteggi di confidenza più bassi. La maggior parte dei partecipanti 30(97%) è stata in grado di raccogliere campioni che hanno portato ad alti tassi di chiamata di genotipizzazione per il tampone con la spugna, mentre solo pochi individui 4(13%) sono stati in grado di raccogliere campioni ad alto tasso di chiamata per entrambi i tipi di tamponi. In conclusione, i tamponi con punta di spugna erano accettabili per i pazienti e fornivano un DNA di buona qualità con una resa sufficiente per i test farmacogenetici basati sulla qPCR.